""DNA-sorb-S-M" ® AmpliSense FBUN Instituto Central de Investigación de Epidemiología de Rospotrebnadzor, Sólo para investigación Federación Rusa, 111123, y otros fines no médicos, la ciudad de Moscú, ..."

INSTRUCCIONES

sobre el uso del kit de reactivos

para la extracción de ADN a partir de material biológico

"DNA-sorb-S-M"

AmpliSense

Instituto Central de Investigación de Epidemiología de la FBUN

Rospotrebnadzor,

Sólo para investigación

Federación Rusa, 111123,

y otros fines no médicos

Moscú, calle Novogireevskaya, 3A

LISTA DE ABREVIACIONES

OBJETIVO

PRINCIPIO DEL MÉTODO

FORMAS DE PAQUETE

EXTRACCIÓN DE ADN DE MATERIAL BIOLÓGICO DE ANIMALES................................ 8

SÍMBOLOS UTILIZADOS EN PRODUCTOS IMPRESOS

Formulario 1: REF К1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / página 2 de 15

LISTA DE ABREVIACIONES

En este manual se utilizan las siguientes abreviaturas y símbolos:

ADN - ácido desoxirribonucleico NA - ácidos nucleicos TC - control de extracción negativo NCO - muestra de control negativo PC - control de extracción positivo PKO - muestra de control positivo PCR - reacción en cadena de la polimerasa

– federales organización financiada por el estado Ciencias

IRC FBUN

OBJETIVO

La extracción de ADN es un procedimiento preanalítico del método PCR.

Volumen de muestra para extracción: 100 µl (se pueden analizar muestras con un volumen de 10 a 100 µl o un peso de 10 a 100 mg)1.

¡ATENCIÓN! Para obtener información sobre el procedimiento de recolección, las condiciones de transporte y almacenamiento del material de prueba, la necesidad y el procedimiento para prepararlo para la extracción de ADN, así como información sobre sustancias que interfieren y restricciones asociadas con la muestra, consulte las instrucciones del kit de reactivos de amplificación utilizado. .

PRINCIPIO DEL MÉTODO

Para algunos tipos de material biológico, se requiere un paso de preparación de muestras. Cm.

instrucciones del kit de reactivos de amplificación utilizado.

Forma 1: REF K1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / página 3 de 15 mediante centrifugación y posterior lavado del sorbente. Cuando se agrega el tampón de elución al sorbente, el NC pasa de la superficie de sílice a la solución, que se separa de las partículas del sorbente mediante centrifugación. Como resultado de este procedimiento se obtiene una preparación de NA altamente purificada, libre de inhibidores de la reacción de amplificación, lo que asegura una alta sensibilidad analítica del estudio de PCR.

FORMAS DE PAQUETE

El kit de reactivos está disponible en 2 configuraciones:

El formulario 1 incluye un conjunto de reactivos "DNA-sorb-S-M" versión 50.

El formulario 2 incluye un conjunto de reactivos "DNA-sorb-S-M" versión 100.

PRECAUCIONES DE SEGURIDAD E INFORMACIÓN SOBRE ELIMINACIÓN

En la investigación de alimentos, aditivos biológicos, piensos para animales o materiales vegetales, el trabajo debe realizarse cumpliendo los requisitos. pautas MU 1.3.2569-09 “Organización del trabajo de los laboratorios que utilizan métodos de amplificación de ácidos nucleicos cuando se trabaja con material que contiene microorganismos de los grupos de patogenicidad I a IV” y GOST R 53214-2008 “Productos alimenticios. Métodos de análisis para la detección de organismos genéticamente modificados y productos derivados de ellos.

Requisitos generales y definiciones”.

Al trabajar, siempre debes cumplir con los siguientes requisitos:

– El proceso de laboratorio debe ser unidireccional. El análisis se realiza en salas (zonas) separadas. Los trabajos deberán iniciarse en la Zona de Extracción y continuar en la Zona de Amplificación y Detección. No devuelva muestras, equipos ni reactivos al área donde se realizó el paso del proceso anterior.

– Los reactivos no utilizados, los reactivos caducados y el Formulario 1: REF K1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / página 4 de 15 reactivos usados, embalajes3, material biológico, incluidos materiales, instrumentos y elementos, se deben eliminar el material biológico contaminado. de acuerdo con los requisitos de SanPiN 2.1.7.2790-10 "Requisitos sanitarios y epidemiológicos para la gestión de residuos médicos".

– Utilizar y cambiar en cada operación puntas desechables para pipetas automáticas con filtro4. Desechable utensilios de plastico debe desecharse en un recipiente especial que contenga un desinfectante que pueda usarse para descontaminar desechos médicos.

– Los utensilios (morteros y majas) y los instrumentos metálicos (bisturíes, tijeras, pinzas, accesorios para batidoras, etc.) utilizados para la preparación de muestras se mantienen en una solución desinfectante (por ejemplo, solución de sal sódica de ácido dicloroisocianúrico al 0,2%) durante una hora, se lavan. con agua del grifo con detergentes tensoactivos y, después de lavar con agua corriente y desionizada, secar en armario de calor seco durante 4 horas a una temperatura de 180 C.

– El kit de reactivos está diseñado para un solo uso para analizar el número especificado de muestras (consulte la sección "Composición").

– El kit de reactivos está listo para su uso según estas instrucciones.

Utilice el kit de reactivos estrictamente para el fin previsto.

– No utilice el kit de reactivos si el embalaje interior está roto o apariencia El reactivo no coincide con la descripción.

– No utilizar el kit de reactivos si no se han respetado las condiciones de transporte y almacenamiento según las instrucciones.

Los reactivos no utilizados, los reactivos caducados, los reactivos usados ​​y los embalajes se clasifican como residuos médicos de clase de peligro G.

Se utilizan puntas desechables sin filtro para eliminar el sobrenadante durante la extracción con un aspirador de vacío.

Formulario 1: REF К1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / página 5 de 15

– No utilice el kit de reactivos más allá de la fecha de vencimiento.

– Utilice guantes desechables sin polvo, batas de laboratorio y protección para los ojos al manipular muestras y reactivos. Lávese bien las manos al finalizar el trabajo. Todas las operaciones se realizan únicamente con guantes para evitar el contacto con el cuerpo humano.

– Evitar la inhalación de vapores, el contacto con la piel, ojos y mucosas, no tragar. En caso de contacto, lave inmediatamente la zona afectada con agua; si es necesario, consulte a un médico. atención médica.

– Las hojas de datos de seguridad de los reactivos (SDS) están disponibles previa solicitud.

Evaluación de eventos probables, como resultado de los cuales pueden ocurrir consecuencias negativas para el cuerpo humano:

Cuando se utiliza para el fin previsto y siguiendo las precauciones anteriores, se excluye el contacto con el cuerpo humano.

En situaciones de emergencia, es posible lo siguiente:

- irritación de la mucosa de los ojos en personas sensibles,

– irritación de la piel en personas sensibles,

- reacción alérgica,

- daño por inhalación,

- daño cuando se toma por vía oral.

Efectos específicos del kit de reactivos en el cuerpo humano:

– Ningún efecto cancerígeno.

- No hay efecto mutagénico.

– Sin toxicidad reproductiva.

MATERIALES Y EQUIPOS ADICIONALES

1. Tubos desechables de polipropileno con rosca o tapón hermético de 1,5 ml y 5,0 ml (p. ej., Axygen, Inc.

(Exgen, Inc.), EE. UU. o equivalente).

2. Puntas desechables para pipetas de volumen variable con filtro de hasta 200 y hasta 1000 µl (por ejemplo, Axygen, Inc. ("Exgen, Inc."), EE.UU., o similar).

3. Puntas desechables para pipetas de volumen variable de hasta 200 µl (p. ej., Axygen, Inc. ("Exgen, Inc."), EE. UU. o similar).

Formulario 1: REF К1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / página 6 de 15

4. Gradillas para tubos de 1,5 ml (por ejemplo, Axygen, Inc. ("Exgen, Inc."), EE. UU. o similar).

5. Caja laminar, seguridad biológica clase II tipo A (por ejemplo, "BAVp-01-"Laminar-S"-1.2", CJSC "Laminar Systems", Rusia, o similar).

6. Termostato para tubos tipo "Eppendorf" de 25 a 100 °C (por ejemplo, SIA Biosan, Letonia, o similar).

7. Termostato-agitador para tubos tipo Eppendorf de 25 a 100 °C (por ejemplo, TS-100, SIA Biosan, Letonia, o similar).

8. Microcentrífuga para tubos de ensayo tipo "Eppendorf" con velocidad máxima centrifugación de al menos 12 mil g (por ejemplo, MiniSpin, Eppendorf ("Eppendorf Manufacturing Corporation"), Manufacturing Corporation Germany o similar).

9. Vortex (por ejemplo, SIA Biosan, Letonia, o similar).

10. Aspirador de vacío médico con matraz trampa para eliminar el sobrenadante (por ejemplo, OM-1, OOO Utes, Rusia o similar).

11. Dispensadores automáticos de volumen variable (por ejemplo, Biohit LLC, Rusia, o similares).

12. Frigorífico de 2 a 8 °С con congelador de menos 24 a menos 16 C.

13. Bata, gorros, zapatos y guantes desechables aparte según MU 1.3.2569-09.

14.Desechable contenedores de plástico para la liberación e inactivación de materiales.

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EXTRACCIÓN DE ADN DE MATERIAL BIOLÓGICO DE ANIMALES

2. Seleccionar el número necesario de tubos desechables de polipropileno de 1,5 ml con tapón de rosca o tapón hermético (incluidos controles de extracción negativos y positivos, si se proporcionan para el estudio de PCR).

Al almacenar el tampón de lisis y la solución de lavado 1 a una temperatura de 2 a 8°C, se puede formar un precipitado en forma de cristales.

Formulario 1: REF К1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / página 8 de 15

3. Agregue 10 µl de VKO6 a cada tubo (si se proporciona para pruebas de PCR). Añadir 400 l de tampón de lisis y 17 l de tampón de lisis a los tubos.

4. Dispense 100 µl de muestras de prueba6 en tubos preparados, utilizando una punta de filtro separada para cada muestra.

¡ATENCIÓN! Se pueden agregar 400 µl de tampón de lisis y 17 µl de reactivo de lisis al tubo con la cantidad requerida de muestra de prueba y se pueden agregar 10 µl de BKO7 (si se proporciona para el estudio de PCR) al mismo tubo usando puntas de filtro separadas.

5. Agregue 100 µl de OKO al tubo de extracción del control negativo (TC), agregue 90 µl de OKO y 10 µl de FKO al tubo de extracción del control positivo (PC) (si se proporcionan controles de extracción para realizar estudios de PCR).6

6. Cierre bien las tapas, mezcle bien y agite las gotas.

Coloque los tubos en un termostato a 64°C durante 1 hora, agitando periódicamente (5 veces cada 10 a 12 minutos). Se permite la incubación durante 12 horas a 60 °C.

7. Precipitar las partículas de muestra no disueltas mediante centrifugación durante 5 minutos a 10 kg (por ejemplo, 12 krpm para microcentrífuga MiniSpin, Eppendorf Manufacturing Corporation).

8. Retire el sobrenadante en un volumen de 200-350 µl con mucho cuidado (evitando la entrada de partículas en suspensión y gotas de grasa) con puntas separadas con filtros y transfiéralo a nuevos tubos de ensayo. Asentar las gotas en el vórtice.

9. Resuspender el sorbente universal mezclándolo intensamente en un vórtex. Agregue 25 µl de sorbente universal resuspendido a cada tubo con una punta separada y cierre bien las tapas.

Vortex, dejar reposar durante 10 minutos, revolviendo cada 2 minutos.

Se permite cambiar el volumen de las muestras de prueba y de control; consulte las instrucciones del kit de reactivos de amplificación utilizado.

Formulario 1: REF К1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / página 9 de 15

18. Repetir el procedimiento de lavado, párrafos siguientes. 15-16, eliminar completamente el sobrenadante.

19. Coloque los tubos de ensayo con las tapas abiertas en un termostato a 64 °C durante 5 a 10 minutos para secar el sorbente universal.

20. Agregue 50–100 µl de tampón de elución B a los tubos (consulte las instrucciones del kit de reactivos de amplificación utilizado).

Vortex hasta que el sorbente esté completamente resuspendido. Colóquelo en un termostato a una temperatura de 64 °C durante 5 a 10 minutos, revolviendo periódicamente (1 vez por minuto) en un vórtex.

El ADN purificado se puede almacenar a una temperatura de 2 a 8 °C durante una semana, a una temperatura de -24 a -16 °C durante 6 meses y a una temperatura que no exceda de -68 °C durante un año. Para hacer esto, sin capturar el sorbente, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de ensayo.

Formulario 1: REF К1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / página 10 de 15

EXTRACCIÓN DE ADN DE ALIMENTOS, SUPLEMENTOS BIOLÓGICOS,

ALIMENTO ANIMAL O ALIMENTO VEGETAL

1. Calentar el tampón de lisis y la solución de lavado 1, si se almacenan entre 2 y 8 °C, a 64 °C hasta que los cristales se disuelvan por completo.

2. Coloque tubos de 1,5 ml con muestras de prueba pretratadas en una gradilla (consulte las instrucciones del kit de reactivos de amplificación utilizado para conocer el volumen/cantidad de la muestra).

3. Prepare un tubo de polipropileno desechable de 1,5 ml con un tapón de rosca o un control de extracción negativo (EC) bien ajustado. Añadir 100 µl de OKO al tubo de ensayo.

4. Agregue 400 µl de tampón de lisis y 17 µl de reactivo de lisis a los tubos de ensayo y a los AO.

5. Cierre bien las tapas, mezcle bien y agite las gotas.

Coloque los tubos de ensayo en un termostato a una temperatura de 64 °C durante 1 hora, agitando periódicamente (5 veces cada 10 a 12 minutos) o utilice un agitador de termostato.

6. Sedimente las partículas de muestra no disueltas mediante centrifugación durante 5 minutos a 10 kg (por ejemplo, 12 krpm para la microcentrífuga MiniSpin, Eppendorf Manufacturing Corporation).

7. Seleccione la cantidad necesaria de nuevos tubos desechables de polipropileno de 1,5 ml con tapones de rosca o tapones herméticos.

8. Resuspender el sorbente universal mezclándolo intensamente en un vórtex. Agregue 25 µl de sorbente universal resuspendido a cada tubo con una punta separada y cierre bien las tapas.

9. De los tubos con muestras lisadas, retire con mucho cuidado el líquido sobrenadante en un volumen de 200–350 µl (evitando la entrada de partículas en suspensión y gotas de grasa) utilizando puntas separadas con filtros y transfiéralo a tubos con un sorbente. Vortex, dejar reposar durante 10 minutos, revolviendo cada 2 minutos.

Formulario 1: REF К1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / página 11 de 15

10. Centrifugar los tubos en una microcentrífuga durante 1 min a 2 kg (por ejemplo, 5 krpm para la microcentrífuga MiniSpin, Eppendorf Manufacturing Corporation).

11. Sin agarrar el sorbente, retire el sobrenadante de cada tubo con una punta separada de 200 µl sin filtro utilizando un aspirador de vacío.

12. Agregue 300 µl de solución de lavado 1 a los tubos, cierre bien las tapas y agite hasta que el sorbente universal esté completamente resuspendido.

13. Centrifugar los tubos en microcentrífuga durante 1 min a 2.000 g.

14. Sin agarrar el sorbente, retire el sobrenadante de cada tubo con una punta separada de 200 µl sin filtro utilizando un aspirador de vacío.

15. Agregue 500 µl de solución de lavado 2 a los tubos, cierre bien las tapas y mezcle en un vórtex hasta que el sorbente universal esté completamente resuspendido.

16. Centrifugar los tubos en una microcentrífuga durante 1 min a 7 kg (por ejemplo, 10 krpm para una microcentrífuga MiniSpin, Eppendorf Manufacturing Corporation).

17. Sin agarrar el sorbente, retire el sobrenadante de cada tubo con una punta separada de 200 µl sin filtro utilizando un aspirador de vacío.

18. Repetir el procedimiento de lavado, párrafos siguientes. 15-16, eliminar completamente el sobrenadante.

19. Coloque los tubos de ensayo con las tapas abiertas en un termostato a una temperatura de 64 °C durante 5 a 10 minutos para secar el sorbente universal.

20. Agregue 50 µl de tampón de elución B a los tubos y agite hasta que el sorbente esté completamente resuspendido. Colóquelo en un termostato a una temperatura de 64 °C durante 5 a 10 minutos, revolviendo periódicamente (1 vez por minuto) en un vórtex.

21. Centrifugar los tubos en microcentrífuga durante 1 min a 10 mil g. El sobrenadante contiene ADN purificado. Las muestras están listas para PCR.

El ADN purificado se puede almacenar a una temperatura de 2 a 8 °C durante una semana, a una temperatura de -24 a -16 °C durante 6 meses y a una temperatura Forma 1: REF K1-6-50-Mod / VER 27.12 .16 / página 12 de 15 no más de -68 °С durante el año. Para hacer esto, sin capturar el sorbente, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de ensayo.

FECHA DE CADUCIDAD, CONDICIONES DE TRANSPORTE Y ALMACENAMIENTO.

Transporte. Un juego de reactivos debe transportarse a una temperatura de 2 a 8 C durante no más de 5 días en contenedores térmicos que contengan bolsas de hielo, todo tipo de cubiertas. Vehículo. Al recibirlo, desmóntelo de acuerdo con las temperaturas de almacenamiento especificadas.

Almacenamiento. Guarde el kit de reactivos a una temperatura de 2 a 25 C, excepto el reactivo de lisis. Guarde el reactivo de lisis en el frigorífico a una temperatura de 2 a 8 C.

Las cámaras frigoríficas deben proporcionar un régimen de temperatura regulado.

El método rápido de extracción de ADN en microcolumnas está diseñado para aislar el ADN total de la sangre, el plasma, la saliva, la orina, los cultivos celulares y cualquier sedimento celular en tampón. La alta pureza del ADN aislado permite su uso para todo tipo de análisis.

el tiempo de aislamiento es de 30 a 45 minutos dependiendo del número de muestras;

• la unión eficaz del ADN a la membrana de la columna permite obtener el mayor rendimiento de ADN de la muestra;
• se logra un alto grado de purificación debido a la composición optimizada de los componentes de las soluciones de lisis y lavado;
• redujo significativamente la fragmentación y la pérdida de ADN durante el lavado en comparación con otros métodos de extracción con sorbentes;
• es posible realizar la concentración de ADN reduciendo el volumen de la solución de elución;
• el aislamiento de ADN en columnas reduce significativamente el consumo de plástico adicional;
• volumen máximo de muestra: 200 µl;
• el kit contiene Proteinasa K;
• la pureza del ADN aislado es de 1,8-1,9 según la relación A260/A280;
• la cantidad de ADN aislado depende del tipo y cantidad de la muestra. El rendimiento medio de ADN de 200 µl de sangre es de 5 a 6 µg.

Conjunto de reactivos para el aislamiento de ADN genómico "DNA-Extran"

Utilizando kits para la extracción de ADN genómico de la serie DNA-Extran, es posible aislar ADN de una variedad de material biológico: sangre, cultivos de células bacterianas y animales, tejidos frescos, congelados o secos de animales y plantas.

• extracción completa de ADN de las células, minimizando la pérdida y fragmentación del ADN durante la purificación;
• El ADN aislado tiene nivel alto pureza (proporción А260/А280 = 1,8-1,9) y adecuado para PCR, restricción, hibridación y otros estudios;
• Los kits no contienen componentes potencialmente peligrosos como fenol y cloroformo, no requieren mucho plástico y no generan residuos tóxicos.

Kit de reactivos para extracción de ADN en partículas magnéticas "M-Sorb-Tub"

Adaptado para el aislamiento de ADN de micobacterias a partir de esputo, lavados bronquiales, líquido cefalorraquídeo, exudado, punteado, biopsia, orina, secreciones del tracto genital y cultivos celulares. El procesamiento preliminar del material clínico se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos estándar para la preparación de muestras en estudios microbiológicos (Orden No. 109 del Ministerio de Salud de la Federación de Rusia del 21 de marzo de 2003 "Sobre la mejora Federación Rusa”, Apéndice 11 “Instrucción sobre métodos unificados de investigación microbiológica en la detección, diagnóstico y tratamiento de la tuberculosis”). Para inactivar el material clínico recomendamos utilizar nuestra solución inactivante A.

La solución A mata las micobacterias en 12 horas y desinfecta el material clínico que puede utilizarse para análisis posteriores (extracción de ADN, PCR, etc.). La solución A está adaptada específicamente para el tratamiento del esputo y reemplaza completamente el procedimiento estándar que utiliza una solución NaOH-NALC y tiene propiedades mucolíticas excepcionales. La solución de inactivación A aumenta el rendimiento de ADN en comparación con la preparación de muestras estándar NaOH-NALC.

El procedimiento de aislamiento incluye: lisis de ADN con isotiocianato de guanidina, sorción de ADN en partículas magnéticas, sedimentación de ADN por centrifugación, pasos de lavado y elución de ADN. Puede usarse para aislar el ADN de otros microorganismos.

el uso de partículas magnéticas recubiertas de gel de sílice como sorbente es un formato tecnológicamente más avanzado y conveniente en comparación con otros sorbentes, permite la máxima estandarización y automatización del procedimiento de extracción de ADN;

Se añade un control positivo interno (IPC) a cada muestra de prueba, la presencia/ausencia de inhibidores de RT-PCR y la eficiencia de la extracción de ADN se juzgan mediante la reacción de amplificación del IPC.

Kits de reactivos para la extracción de ADN de productos alimenticios y materias primas alimentarias.

Los kits de reactivos "Sorb-GMO-A" y "Sorb-GMO-B" están diseñados específicamente para la extracción de ADN de materiales vegetales, alimentos y piensos. Ambos kits de purificación de ADN utilizan sorbente de silicio. "Sorb-GMO-A" contiene cloruro de guanidina como agente lisante, "Sorb-GMO-B" es un detergente iónico STAB que proporciona el máximo rendimiento de ADN a partir de componentes vegetales. Características distintivas Las características del kit "Sorb-GMO-A" son la velocidad de extracción del ADN y la ausencia de cloroformo, lo que hace que trabajar con el kit sea más seguro.

Kit de reactivos para extracción de ADN de muestras de agua (sobre partículas magnéticas) "M-Sorb-Leg"

Diseñado para aislar el ADN de Legionella de cuerpos de agua ambiente(torres de enfriamiento, piscinas, parques acuáticos, sistemas de suministro de agua fría y caliente). La concentración mínima recuperada de Legionella es de 100 células por 0,5 L de muestra.

El juego "M-Sorb-Leg" se produce en dos modificaciones: "M-Sorb-Leg1000" para muestras de agua con un volumen de 1-1000 ml y "M-Sorb-Leg1" para muestras de agua de hasta 1 ml. El juego M-Sorb-Leg1000 permite la filtración de agua mediante un filtro de policarbonato.

un conjunto de reactivos "M-Sorb-Leg" le permite deshacerse de los inhibidores de la PCR presentes en muestras de agua altamente contaminadas;

• La técnica de aislamiento de ADN se basa en la sorción de ADN en partículas magnéticas recubiertas de gel de sílice seguida de precipitación con un reactivo precipitante. Combina las ventajas de los métodos de sorción y el método de precipitación total;
• Se agrega un control positivo interno (IPC) a cada muestra de prueba y la presencia/ausencia de inhibidores de RT-PCR se juzga mediante la reacción de amplificación de IPC.

Un conjunto de reactivos para la extracción de ADN de objetos ambientales (en partículas magnéticas) "M-Sorb-OOM"

El kit de reactivos M-Sorb-OOM está diseñado para aislar ADN de objetos ambientales (suelo, agua, cadáveres de animales, etc.) sospechosos de estar infectados con microorganismos altamente peligrosos (OOM), con el fin de prepararlos para su posterior análisis mediante métodos reales. tiempo de PCR. El procedimiento de extracción es similar al descrito para el conjunto M-Sorb-Leg.

Kit de reactivos para aislamiento de ARN "RNA-Extran"

El kit está destinado al aislamiento de ARN de sangre, fragmentos de tejido y cultivos celulares. El ARN obtenido con el kit RNA-Extran se puede utilizar tanto para RT-PCR como para análisis de hibridación, traducción in vitro y clonación.

El principio de aislamiento del ARN se basa en la extracción ácida con fenol según Chomchinsky, en la que solo el ARN permanece en la fase acuosa y el ADN, en combinación con proteínas, pasa a la fase orgánica. El tiocianato de guanidina se utiliza como agente que aísla y desnaturaliza las nucleasas celulares.

permite obtener ARN altamente purificado, libre de impurezas del ADN;

proporciona una extracción completa de ARN de sangre total, fragmentos de tejido y cultivos celulares;

le permite obtener ARN intacto;

• Tiempo de aislamiento de ARN: 1 hora.

Solución lisante 30 cm 3 ,

Solución de lavado 1 30 cm 3 ,

Concentrado para solución limpiadora 2 20 cm 3 ,

Suspensión absorbente 2 cm 3,

Tampón de elución de ADN 4 cm3.

Procedimiento de operación:

Prepare la solución de lavado 2, para ello mezcle 20 cm 3 del concentrado del kit, 80 cm 3 de agua destilada y 100 cm3 de etanol al 96% en una botella aparte. Guarde la solución a temperatura ambiente en un vial bien cerrado.

Verifique el estado del sorbente; al sedimentar, debe ocupar aproximadamente la mitad del volumen de la suspensión.

En un tubo de polipropileno de 1,5 cm 3 bien cerrado (preferiblemente con tapón de rosca), agregue 100 µl de una muestra de prueba previamente preparada, negativa o positiva, agregue 300 µl de solución lisante (a cada muestra con una punta separada) y mezcle bien pipetear de 3 a 10 veces.

Añadir 15 - 20 µl del sorbente resuspendido, mezclar bien en un vórtex y colocar en una rejilla durante 5 a 7 minutos para que el sorbente se sedimente por completo.

Sedimente el sorbente en una microcentrífuga durante 30 segundos a 3-8 mil rpm. Tomar el sobrenadante de cada tubo con una punta separada (es conveniente utilizar succión al vacío).

Agregar 300 μl de solución de lavado 1, mezclar en un vórtex hasta que el sorbente esté completamente resuspendido (si el sorbente se rompe mal, romperlo con una pipeta), precipitar en una centrífuga a 4-8 mil rpm durante 30 segundos. Retire el sobrenadante de cada tubo con una punta separada.

Agregar 800 μl de solución de lavado 2, mezclar en un vórtex hasta que el sorbente esté completamente resuspendido, precipitar en una microcentrífuga a 6-10 mil rpm durante 30 segundos, tomar el sobrenadante.

Repetir el paso 6, seleccionar cuidadosamente el sobrenadante, secar el precipitado sorbente en un termostato a 65°C durante 5 min.

Resuspender el sorbente en 30–40 µl de tampón de elución, colocar en un termostato a 65°C durante 5 minutos, agitando periódicamente.

Sedimentar en microcentrífuga a una velocidad máxima de 1 min.

La muestra está lista para PCR, el sobrenadante contiene ADN purificado.

Como control negativo en la etapa de extracción de ADN, es necesario utilizar solución salina o agua desionizada.

La eficiencia de la extracción de ADN con el kit DNA-sorb-PCR es del 30 al 60%.

5.2. Etapa 2. Composición de configuración de PCR del kit para amplificación por PCR:

Tampón de reacción 5x 1000 µl (solución azul transparente viscosa)

Agua desionizada.2000 µl

Mezcla de nucleótidos.500 µl

Taq polimerasa.100 µl

Mezcla de imprimación.500 µl

Cera para PCR.2000 µl

Control positivo 100 µl

Control negativo 100 µl

Aceite mineral 4000 µl

El kit se almacena a -20°C durante un año.