""DNA-sorb-S-M" ® AmpliSense FBUN Central Research Institute of Epidemiology ng Rospotrebnadzor, Para lamang sa pagsasaliksik sa Russian Federation, 111123, at iba pang hindi medikal na layunin, ang lungsod ng Moscow, ..."

MGA TAGUBILIN

sa paggamit ng reagent kit

para sa pagkuha ng DNA mula sa biological na materyal

"DNA-sorb-S-M"

AmpliSense

FBUN Central Research Institute of Epidemiology

Rospotrebnadzor,

Para sa Pananaliksik Lamang

Russian Federation, 111123,

at iba pang di-medikal na layunin

Moscow, kalye ng Novogireevskaya, 3A

LISTAHAN NG MGA daglat

LAYUNIN

PRINSIPYO NG PARAAN

MGA FORM NG PACKAGE

EXTRACTION OF DNA MULA SA BIOLOHIKAL NA MATERYAL MULA SA MGA HAYOP.................................. 8

MGA SIMBOLO NA GINAGAMIT SA MGA PRINTED NA PRODUKTO

Form 1: REF К1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / page 2 ng 15

LISTAHAN NG MGA daglat

Ang mga sumusunod na pagdadaglat at simbolo ay ginagamit sa manwal na ito:

DNA - deoxyribonucleic acid NA - mga nucleic acid TC - negatibong pagkuha ng kontrol NCO - negatibong control sample PC - positibong extraction control PKO - positibong control sample PCR - polymerase chain reaction

– Pederal organisasyong pinondohan ng estado Mga agham

FBUN CRI

LAYUNIN

Ang pagkuha ng DNA ay isang preanalytical na pamamaraan ng PCR method.

Dami ng sample para sa pagkuha: 100 µl (maaaring masuri ang mga sample na may volume na 10 hanggang 100 µl o bigat na 10 hanggang 100 mg)1.

PANSIN! Para sa impormasyon sa pamamaraan ng pagkolekta, mga kondisyon para sa pagdadala at pag-iimbak ng materyal sa pagsubok, ang pangangailangan at pamamaraan para sa paghahanda nito para sa pagkuha ng DNA, pati na rin ang impormasyon sa mga nakakasagabal na sangkap at mga paghihigpit na nauugnay sa sample, tingnan ang mga tagubilin para sa amplification reagent kit na ginamit. .

PRINSIPYO NG PARAAN

Para sa ilang uri ng biological na materyal, kinakailangan ang isang sample na hakbang sa paghahanda. Cm.

mga tagubilin para sa amplification reagent kit na ginamit.

Form 1: REF K1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / page 3 ng 15 sa pamamagitan ng centrifugation at kasunod na paghuhugas ng sorbent. Kapag ang elution buffer ay idinagdag sa sorbent, ang NC ay pumasa mula sa ibabaw ng silica patungo sa solusyon, na kung saan ay pinaghihiwalay mula sa mga partikulo ng sorbent sa pamamagitan ng sentripugasyon. Bilang resulta ng pamamaraang ito, ang isang mataas na purified NA paghahanda ay nakuha, libre mula sa mga inhibitor ng amplification reaction, na nagsisiguro ng mataas na analytical sensitivity ng PCR study.

MGA FORM NG PACKAGE

Available ang reagent kit sa 2 configuration:

Kasama sa Form 1 ang isang set ng mga reagents na "DNA-sorb-S-M" na bersyon 50.

Kasama sa Form 2 ang isang set ng mga reagents na "DNA-sorb-S-M" na bersyon 100.

MGA PAG-INGAT SA KALIGTASAN AT IMPORMASYON SA PAGTApon

Kapag nagsasaliksik ng pagkain, biological additives, feed ng hayop o halaman, dapat isagawa ang trabaho alinsunod sa mga kinakailangan mga alituntunin MU 1.3.2569-09 "Organisasyon ng gawain ng mga laboratoryo gamit ang mga pamamaraan ng pagpapalakas ng nucleic acid kapag nagtatrabaho sa materyal na naglalaman ng mga microorganism ng pathogenicity group I–IV" at GOST R 53214-2008 "Mga produktong pagkain. Mga pamamaraan ng pagsusuri para sa pagtuklas ng mga genetically modified na organismo at mga produkto na nagmula sa kanila.

Pangkalahatang mga kinakailangan at kahulugan".

Kapag nagtatrabaho, dapat mong palaging sumunod sa mga sumusunod na kinakailangan:

– Ang proseso ng laboratoryo ay dapat na unidirectional. Ang pagsusuri ay isinasagawa sa magkakahiwalay na mga silid (mga zone). Dapat magsimula ang trabaho sa Extraction Zone at magpatuloy sa Amplification and Detection Zone. Huwag ibalik ang mga specimen, kagamitan, at reagents sa lugar kung saan isinagawa ang nakaraang hakbang sa proseso.

– Mga hindi nagamit na reagents, expired na reagents, at Form 1: REF K1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / page 4 ng 15 ginamit na reagents, packaging3, biological material, kabilang ang mga materyales, instrumento at item na kontaminadong biological material ay dapat itapon alinsunod sa mga kinakailangan ng SanPiN 2.1.7.2790-10 "Mga kinakailangan sa sanitary at epidemiological para sa pamamahala ng medikal na basura".

– Gamitin at baguhin sa bawat operasyon ang mga disposable na tip para sa mga awtomatikong pipette na may filter4. Disposable mga plastik na kagamitan ay dapat na itapon sa isang espesyal na lalagyan na naglalaman ng disinfectant na maaaring magamit upang ma-decontaminate ang mga medikal na basura.

– Ang mga kagamitan (mortar at pestles) at mga metal na instrumento (scalpels, gunting, sipit, blender attachment, atbp.) na ginagamit para sa paghahanda ng sample ay inilalagay sa isang disinfectant solution (halimbawa, 0.2% dichloroisocyanuric acid sodium salt solution) sa loob ng isang oras, hinugasan gamit ang gripo ng tubig na may surface-active detergents at, pagkatapos hugasan sa tumatakbo at deionized na tubig, tuyo sa isang dry-heat cabinet sa loob ng 4 na oras sa temperatura na 180 C.

– Ang reagent kit ay inilaan para sa solong paggamit para sa pagsubok sa tinukoy na bilang ng mga sample (tingnan ang seksyong "Komposisyon").

– Ang reagent kit ay handa nang gamitin ayon sa mga tagubiling ito.

Gamitin ang reagent kit nang mahigpit para sa layunin nito.

– Huwag gamitin ang reagent kit kung sira ang panloob na packaging o hitsura ang reagent ay hindi tumutugma sa paglalarawan.

– Huwag gamitin ang reagent kit kung ang mga kondisyon ng transportasyon at imbakan ayon sa mga tagubilin ay hindi nasunod.

Ang mga hindi nagamit na reagents, expired na reagents, ginamit na reagents, packaging ay inuri bilang medical waste hazard class G.

Ang mga disposable na tip na walang filter ay ginagamit upang alisin ang supernatant sa panahon ng pagkuha gamit ang isang vacuum aspirator.

Form 1: REF К1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / page 5 ng 15

– Huwag gamitin ang reagent kit na lampas sa petsa ng pag-expire.

– Gumamit ng disposable powder-free na guwantes, lab coat, at proteksyon sa mata kapag humahawak ng mga sample at reagents. Hugasan nang maigi ang mga kamay sa pagtatapos ng trabaho. Ang lahat ng mga operasyon ay isinasagawa lamang gamit ang mga guwantes upang maiwasan ang pakikipag-ugnay sa katawan ng tao.

– Iwasan ang paglanghap ng singaw, pagkadikit sa balat, mata at mauhog na lamad, huwag lunukin. Sa kaso ng pagkakadikit, agad na banlawan ng tubig ang apektadong lugar; kung kinakailangan, humingi ng medikal na payo. Medikal na pangangalaga.

– Available ang mga reagent safety data sheet (SDS) kapag hiniling.

Pagtatasa ng mga posibleng kaganapan, bilang isang resulta kung saan maaaring mangyari ang mga negatibong kahihinatnan para sa katawan ng tao:

Kapag ginamit para sa layunin nito at sumusunod sa mga pag-iingat sa itaas, hindi kasama ang pakikipag-ugnayan sa katawan ng tao.

Sa mga emergency na sitwasyon, posible ang mga sumusunod:

- pangangati ng mauhog lamad ng mga mata sa mga sensitibong tao,

- pangangati ng balat sa mga sensitibong tao,

- reaksiyong alerdyi,

- pinsala sa pamamagitan ng paglanghap,

- pinsala kapag kinuha sa bibig.

Mga partikular na epekto ng reagent kit sa katawan ng tao:

- Walang carcinogenic effect.

- Walang mutagenic effect.

– Walang reproductive toxicity.

MGA KARAGDAGANG MATERYAL AT KAGAMITAN

1. Mga disposable na 1.5 ml at 5.0 ml na polypropylene screw o masikip na mga tubo ng takip (hal., Axygen, Inc.

(Exgen, Inc.), USA, o katumbas nito).

2. Mga disposable na tip para sa variable volume pipette na may filter na hanggang 200 at hanggang 1000 µl (halimbawa, Axygen, Inc. ("Exgen, Inc."), USA, o katulad nito).

3. Mga disposable na tip para sa variable volume pipette hanggang 200 µl (hal., Axygen, Inc. ("Exgen, Inc."), USA, o katulad nito).

Form 1: REF К1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / page 6 ng 15

4. 1.5 ml na tube rack (halimbawa, Axygen, Inc. ("Exgen, Inc."), USA, o katulad nito).

5. Laminar box, biological safety class II type A (halimbawa, "BAVp-01-"Laminar-S"-1.2", CJSC "Laminar Systems", Russia, o katulad nito).

6. Thermostat para sa "Eppendorf" type tubes mula 25 hanggang 100 °C (halimbawa, SIA Biosan, Latvia, o katulad nito).

7. Thermostat-shaker para sa Eppendorf type tubes mula 25 hanggang 100 °C (halimbawa, TS-100, SIA Biosan, Latvia, o katulad).

8. Microcentrifuge para sa mga test tube na uri ng "Eppendorf" na may pinakamataas na bilis centrifugation ng hindi bababa sa 12 thousand g (halimbawa, MiniSpin, Eppendorf ("Eppendorf Manufacturing Corporation"), Manufacturing Corporation Germany, o katulad nito).

9. Vortex (halimbawa, SIA Biosan, Latvia, o katulad nito).

10. Medikal na vacuum aspirator na may trap flask para alisin ang supernatant (halimbawa, OM-1, OOO Utes, Russia, o katulad nito).

11. Mga awtomatikong dispenser na may variable na volume (halimbawa, Biohit LLC, Russia, o katulad).

12. Refrigerator mula 2 hanggang 8 ° С na may freezer mula sa minus 24 hanggang sa minus 16 C.

13. Isang hiwalay na dressing gown, cap, sapatos at disposable gloves ayon sa MU 1.3.2569-09.

14. Disposable Lalagyang plastik para sa pagpapalabas at hindi aktibo ng mga materyales.

–  –  –

EXTRACTION NG DNA MULA SA BIOLOGICAL MATERIAL MULA SA MGA HAYOP

2. Piliin ang kinakailangang bilang ng mga disposable 1.5 ml polypropylene tubes na may screw caps o tight-fitting caps (kabilang ang mga negatibo at positibong kontrol sa pagkuha, kung ang mga ito ay ibinigay para sa PCR study).

Kapag iniimbak ang lyse buffer at wash solution 1 sa temperatura na 2 hanggang 8°C, maaaring mabuo ang isang precipitate sa anyo ng mga kristal.

Form 1: REF К1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / page 8 ng 15

3. Magdagdag ng 10 µl ng VKO6 sa bawat tubo (kung ito ay ibinigay para sa pagsusuri sa PCR). Magdagdag ng 400 µl lyse buffer at 17 µl lyse buffer sa mga tubo.

4. Ibuhos ang 100 µl ng mga sample ng pagsubok6 sa mga inihandang tubo, gamit ang isang hiwalay na tip ng filter para sa bawat sample.

PANSIN! Ang 400 µl ng lyse buffer at 17 µl ng lyse reagent ay maaaring idagdag sa tube na may kinakailangang dami ng test sample at 10 µl ng BKO7 (kung ibinigay para sa PCR study) ay maaaring idagdag sa parehong tubo gamit ang magkahiwalay na mga tip sa filter.

5. Magdagdag ng 100 µl ng OKO sa negative control (TC) extraction tube, magdagdag ng 90 µl ng OKO at 10 µl ng FKO sa positive control (PC) extraction tube (kung ang mga extraction control ay ibinigay para sa pagsasagawa ng PCR studies).6

6. Isara nang mahigpit ang mga takip, ihalo nang lubusan at i-vortex ang mga patak.

Ilagay ang mga tubo sa isang thermostat sa 64°C sa loob ng 1 oras, pana-panahong pag-vortex (5 beses bawat 10–12 min). Ang incubation ay pinapayagan sa loob ng 12 oras sa 60 °C.

7. Latakin ang mga hindi natutunaw na sample na particle sa pamamagitan ng centrifugation sa loob ng 5 min sa 10 kg (hal. 12 krpm para sa MiniSpin microcentrifuge, Eppendorf Manufacturing Corporation).

8. Alisin ang supernatant sa dami ng 200-350 µl nang maingat (iwasan ang pagpasok ng mga nasuspinde na particle at fat droplets) na may magkahiwalay na tip na may mga filter at ilipat sa mga bagong test tube. Pag-aayos ng mga patak sa puyo ng tubig.

9. Muling suspindihin ang unibersal na sorbent sa pamamagitan ng masinsinang paghahalo sa isang puyo ng tubig. Magdagdag ng 25 µl ng resuspended universal sorbent sa bawat tubo na may hiwalay na dulo, mahigpit na isara ang mga takip.

Vortex, iwanan sa isang rack para sa 10 minuto, pagpapakilos bawat 2 minuto.

Pinapayagan na baguhin ang dami ng mga sample ng pagsubok at kontrol, tingnan ang mga tagubilin para sa amplification reagent kit na ginamit.

Form 1: REF К1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / page 9 ng 15

18. Ulitin ang pamamaraan ng paghuhugas, kasunod ng mga talata. 15–16, ganap na alisin ang supernatant.

19. Ilagay ang mga test tube na may bukas na takip sa isang thermostat sa 64 °C sa loob ng 5–10 min upang matuyo ang unibersal na sorbent.

20. Magdagdag ng 50–100 µl ng elution buffer B sa mga tubo (tingnan ang mga tagubilin para sa amplification reagent kit na ginamit).

Vortex hanggang sa tuluyang masuspinde ang sorbent. Ilagay sa isang thermostat na may temperaturang 64 °C sa loob ng 5–10 minuto, pana-panahon (1 oras bawat minuto) na hinahalo sa isang vortex.

Ang purified DNA ay maaaring itago sa temperaturang 2 hanggang 8 °C sa loob ng isang linggo, sa temperaturang minus 24 hanggang minus 16 °C sa loob ng 6 na buwan at sa temperaturang hindi hihigit sa minus 68 °C sa loob ng isang taon. Upang gawin ito, kinakailangan, nang hindi kumukuha ng sorbent, upang ilipat ang supernatant sa isang bagong test tube.

Form 1: REF К1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / page 10 ng 15

PAGHAHAGI NG DNA MULA SA PAGKAIN, BIOLOHIKAL NA SUPPLEMENT,

PAGKAIN NG HAYOP O PAGKAIN NG HALAMAN

1. Painitin ang lyse buffer at wash solution 1, kung nakaimbak sa 2 hanggang 8°C, sa 64°C hanggang sa ganap na matunaw ang mga kristal.

2. Maglagay ng 1.5 ml na tubo na may mga pre-treated na test sample sa isang rack (tingnan ang mga tagubilin para sa amplification reagent kit na ginamit para sa sample volume/dami).

3. Maghanda ng isang disposable 1.5 ml polypropylene tube na may takip ng tornilyo o isang mahigpit na angkop na negative extraction control (EC). Magdagdag ng 100 µl ng OKO sa test tube.

4. Magdagdag ng 400 µl ng lyse buffer at 17 µl ng lyse reagent sa mga test tube at OC.

5. Isara nang mahigpit ang mga takip, ihalo nang lubusan at i-vortex ang mga patak.

Ilagay ang mga test tube sa isang thermostat sa temperatura na 64 °C sa loob ng 1 oras, pana-panahong pag-vortex (5 beses bawat 10–12 min), o gumamit ng thermostat-shaker.

6. Latakin ang mga hindi natutunaw na sample particle sa pamamagitan ng sentripugasyon sa loob ng 5 min sa 10 kg (hal. 12 krpm para sa MiniSpin microcentrifuge, Eppendorf Manufacturing Corporation).

7. Piliin ang kinakailangang bilang ng mga bagong disposable na 1.5 ml na polypropylene tube na may mga takip ng tornilyo o mga takip na masikip.

8. Muling suspindihin ang unibersal na sorbent sa pamamagitan ng masinsinang paghahalo sa isang puyo ng tubig. Magdagdag ng 25 µl ng resuspended universal sorbent sa bawat tubo na may hiwalay na dulo, mahigpit na isara ang mga takip.

9. Mula sa mga tubo na may mga lysed na sample, alisin ang supernatant liquid sa dami na 200–350 µl nang maingat (iwasan ang pagpasok ng mga nasuspinde na particle at fat drop) gamit ang magkahiwalay na tip na may mga filter at ilipat sa mga tubo na may sorbent. Vortex, iwanan sa isang rack para sa 10 minuto, pagpapakilos bawat 2 minuto.

Form 1: REF К1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / page 11 ng 15

10. Centrifuge tubes sa isang microcentrifuge para sa 1 min sa 2 kg (hal. 5 krpm para sa MiniSpin microcentrifuge, Eppendorf Manufacturing Corporation).

11. Nang hindi hinahawakan ang sorbent, alisin ang supernatant sa bawat tubo na may hiwalay na 200 µl tip na walang filter gamit ang vacuum aspirator.

12. Magdagdag ng 300 µl ng wash solution 1 sa mga tubo, mahigpit na isara ang mga lids, puyo ng tubig hanggang sa ganap na masuspinde muli ang unibersal na sorbent.

13. I-centrifuge ang mga tubo sa isang microcentrifuge sa loob ng 1 min sa 2,000 g.

14. Nang hindi hinahawakan ang sorbent, alisin ang supernatant sa bawat tubo na may hiwalay na 200 µl tip na walang filter gamit ang vacuum aspirator.

15. Magdagdag ng 500 µl ng wash solution 2 sa mga tubo, mahigpit na isara ang mga takip, ihalo sa isang puyo ng tubig hanggang ang unibersal na sorbent ay ganap na muling masuspinde.

16. I-centrifuge ang mga tubo sa isang microcentrifuge sa loob ng 1 min sa 7 kg (hal. 10 krpm para sa isang MiniSpin microcentrifuge, Eppendorf Manufacturing Corporation).

17. Nang hindi hinahawakan ang sorbent, alisin ang supernatant sa bawat tubo na may hiwalay na 200 µl tip na walang filter gamit ang vacuum aspirator.

18. Ulitin ang pamamaraan ng paghuhugas, kasunod ng mga talata. 15-16, ganap na alisin ang supernatant.

19. Ilagay ang mga test tube na may bukas na takip sa isang thermostat na may temperaturang 64 °C sa loob ng 5-10 minuto upang matuyo ang unibersal na sorbent.

20. Magdagdag ng 50 µl ng elution buffer B sa mga tubo. Vortex hanggang sa tuluyang masuspinde ang sorbent. Ilagay sa isang thermostat na may temperaturang 64 °C sa loob ng 5–10 minuto, pana-panahon (1 oras bawat minuto) na hinahalo sa isang vortex.

21. Centrifuge ang mga tubo sa isang microcentrifuge para sa 1 min sa 10 thousand g. Ang supernatant ay naglalaman ng purified DNA. Ang mga sample ay handa na para sa PCR.

Maaaring maimbak ang purified DNA sa temperaturang 2 hanggang 8 °C sa loob ng isang linggo, sa temperatura na -24 hanggang -16 °C sa loob ng 6 na buwan at sa temperatura Form 1: REF K1-6-50-Mod / VER 27.12 .16 / pahina 12 ng 15 na hindi mas mataas sa minus 68 °С sa buong taon. Upang gawin ito, kinakailangan, nang hindi kumukuha ng sorbent, upang ilipat ang supernatant sa isang bagong test tube.

EXPIRY DATE, TRANSPORTASYON AT MGA KUNDISYON SA PAG-IMBOK.

Transportasyon. Ang isang set ng mga reagents ay dapat dalhin sa temperatura na 2 hanggang 8 C nang hindi hihigit sa 5 araw sa mga thermal container na naglalaman ng mga ice pack, lahat ng uri ng sakop Sasakyan. Sa pagtanggap, i-disassemble ayon sa tinukoy na temperatura ng imbakan.

Imbakan. Itabi ang reagent kit sa temperaturang 2 hanggang 25 C, maliban sa lyse reagent. Itabi ang lysing reagent sa refrigerator sa temperaturang 2 hanggang 8 C.

Ang mga refrigerating chamber ay dapat magbigay ng regulated temperature regime.

Ang mabilis na microcolumn na paraan ng pagkuha ng DNA ay idinisenyo upang ihiwalay ang kabuuang DNA mula sa dugo, plasma, laway, ihi, mga kultura ng cell, at anumang mga cell pellet sa buffer. Ang mataas na kadalisayan ng nakahiwalay na DNA ay nagpapahintulot na magamit ito para sa lahat ng uri ng pagsusuri.

Ang oras ng paghihiwalay ay 30 hanggang 45 minuto depende sa bilang ng mga sample;

• Ang epektibong pagbubuklod ng DNA sa lamad ng haligi ay nagbibigay-daan sa pagkuha ng pinakamataas na ani ng DNA mula sa sample;
• ang isang mataas na antas ng paglilinis ay nakamit dahil sa na-optimize na komposisyon ng mga bahagi ng lysing at washing solution;
• makabuluhang nabawasan ang pagkapira-piraso at pagkawala ng DNA sa panahon ng paghuhugas kumpara sa iba pang paraan ng pagkuha ng sorbent;
• posible na isakatuparan ang konsentrasyon ng DNA sa pamamagitan ng pagbabawas ng dami ng elution solution;
• Ang paghihiwalay ng DNA sa mga haligi ay makabuluhang binabawasan ang pagkonsumo ng karagdagang plastic;
• maximum na dami ng sample - 200 µl;
• ang kit ay naglalaman ng Proteinase K;
• ang kadalisayan ng nakahiwalay na DNA ay 1.8-1.9 ayon sa ratio na A260/A280;
• ang dami ng DNA na nakahiwalay ay depende sa uri at dami ng sample. Ang ani ng DNA mula sa 200 µl ng dugo ay nasa average na 5-6 µg.

Set ng mga reagents para sa pagkuha ng genomic DNA "DNA-Extran"

Gamit ang mga kit para sa pagkuha ng genomic DNA ng DNA-Extran series, posibleng ihiwalay ang DNA mula sa iba't ibang biological material: dugo, mga kultura ng bacterial at animal cells, sariwa, frozen o tuyo na mga tisyu ng mga hayop at halaman.

• kumpletong pagkuha ng DNA mula sa mga selula, pinapaliit ang pagkawala at pagkapira-piraso ng DNA sa panahon ng paglilinis;
• may nakahiwalay na DNA mataas na lebel kadalisayan (ratio А260/А280 = 1.8-1.9) at angkop para sa PCR, paghihigpit, hybridization at iba pang pag-aaral;
• ang mga kit ay hindi naglalaman ng mga potensyal na mapanganib na sangkap tulad ng phenol at chloroform, hindi nangangailangan ng maraming plastic at hindi gumagawa ng nakakalason na basura.

Reagent kit para sa pagkuha ng DNA sa mga magnetic particle na "M-Sorb-Tub"

Iniangkop para sa paghihiwalay ng mycobacteria DNA mula sa sputum, bronchial washings, cerebrospinal fluid, exudate, punctate, biopsy, ihi, genital tract secretions, cell culture. Ang paunang pagproseso ng klinikal na materyal ay isinasagawa alinsunod sa mga karaniwang pamamaraan para sa paghahanda ng sample sa microbiological studies (Order No. 109 ng Ministry of Health ng Russian Federation na may petsang Marso 21, 2003 "Sa pagpapabuti Pederasyon ng Russia”, Appendix 11 “Pagtuturo sa pinag-isang pamamaraan ng microbiological research sa pagtuklas, pagsusuri at paggamot ng tuberculosis”). Upang hindi aktibo ang klinikal na materyal, inirerekomenda namin ang paggamit ng aming hindi aktibo na solusyon A.

Ang Solution A ay pumapatay ng mycobacteria sa loob ng 12 oras at nagdidisimpekta ng klinikal na materyal na maaaring magamit para sa karagdagang pagsusuri (pagkuha ng DNA, PCR, atbp.). Ang Solusyon A ay partikular na inangkop para sa paggamot ng plema at ganap na pinapalitan ang karaniwang pamamaraan gamit ang NaOH-NALC na solusyon, ay may natatanging mucolytic na katangian. Ang Inactivation Solution A ay nagpapataas ng ani ng DNA kumpara sa karaniwang paghahanda ng sample ng NaOH-NALC.

Kasama sa pamamaraan ng paghihiwalay ang: DNA lysis na may guanidine isothiocyanate, DNA sorption sa magnetic particle, DNA sedimentation sa pamamagitan ng centrifugation, washing steps, at DNA elution. Maaaring gamitin upang ihiwalay ang DNA ng iba pang mga microorganism.

ang paggamit ng silica gel-coated magnetic particle bilang isang sorbent ay isang mas teknolohikal na advanced at maginhawang format kumpara sa iba pang mga sorbents, pinapayagan nito ang maximum na standardisasyon at automation ng pamamaraan ng pagkuha ng DNA;

isang panloob na positibong kontrol (IPC) ay idinagdag sa bawat sample ng pagsubok, ang presensya/kawalan ng mga RT-PCR inhibitors at ang kahusayan ng pagkuha ng DNA ay hinuhusgahan ng IPC amplification reaction.

Reagent kit para sa pagkuha ng DNA mula sa mga produktong pagkain at hilaw na materyales ng pagkain

Ang mga reagent kit na "Sorb-GMO-A" at "Sorb-GMO-B" ay partikular na idinisenyo para sa pagkuha ng DNA mula sa mga materyales ng halaman, pagkain at feed. Ang parehong DNA purification kit ay gumagamit ng silicon sorbent. Ang "Sorb-GMO-A" ay naglalaman ng guanidine chloride bilang isang lysing agent, ang "Sorb-GMO-B" ay naglalaman ng isang ionic detergent STAB, na nagbibigay ng pinakamataas na ani ng DNA mula sa mga bahagi ng halaman. Mga natatanging tampok ng "Sorb-GMO-A" kit ay ang bilis ng pagkuha ng DNA at ang kawalan ng chloroform, na ginagawang mas ligtas ang pagtatrabaho sa kit.

Reagent kit para sa pagkuha ng DNA mula sa mga sample ng tubig (sa magnetic particle) "M-Sorb-Leg"

Idinisenyo upang ihiwalay ang Legionella DNA mula sa mga anyong tubig kapaligiran(mga cooling tower, swimming pool, water park, mainit at malamig na sistema ng supply ng tubig). Ang pinakamababang nakuhang konsentrasyon ng Legionella ay 100 cell bawat 0.5 L ng sample.

Ang set na "M-Sorb-Leg" ay ginawa sa dalawang pagbabago: "M-Sorb-Leg1000" para sa mga sample ng tubig na may dami na 1-1000 ml at "M-Sorb-Leg1" para sa mga sample ng tubig hanggang sa 1 ml. Ang M-Sorb-Leg1000 set ay nagbibigay para sa pagsasala ng tubig gamit ang isang polycarbonate filter.

ang isang hanay ng mga reagents na "M-Sorb-Leg" ay nagpapahintulot sa iyo na mapupuksa ang mga PCR inhibitor na naroroon sa mataas na kontaminadong mga sample ng tubig;

• Ang pamamaraan ng paghihiwalay ng DNA ay batay sa sorption ng DNA sa mga silica gel-coated na magnetic particle na sinusundan ng precipitation na may precipitating reagent. Pinagsasama ang mga pakinabang ng mga pamamaraan ng sorption at ang paraan ng kabuuang pag-ulan;
• isang panloob na positibong kontrol (IPC) ay idinagdag sa bawat sample ng pagsubok, at ang presensya/kawalan ng mga RT-PCR inhibitor ay hinuhusgahan ng IPC amplification reaction.

Isang set ng mga reagents para sa pagkuha ng DNA mula sa mga bagay sa kapaligiran (sa mga magnetic particle) "M-Sorb-OOM"

Ang M-Sorb-OOM reagent kit ay idinisenyo upang ihiwalay ang DNA mula sa mga bagay sa kapaligiran (lupa, tubig, bangkay ng hayop, atbp.) na pinaghihinalaang nahawaan ng mga lubhang mapanganib na microorganism (OOM), upang maihanda ang mga ito para sa kasunod na pagsusuri sa pamamagitan ng real- oras ng PCR. Ang pamamaraan ng pagkuha ay katulad ng inilarawan para sa M-Sorb-Leg set.

Reagent kit para sa RNA isolation "RNA-Extran"

Ang kit ay inilaan para sa paghihiwalay ng RNA mula sa dugo, mga fragment ng tissue, mga kultura ng cell. Ang RNA na nakuha gamit ang RNA-Extran kit ay maaaring magamit kapwa para sa RT-PCR at para sa pagsusuri ng hybridization, in vitro translation, at cloning.

Ang prinsipyo ng paghihiwalay ng RNA ay batay sa pagkuha ng acid phenol ayon kay Chomchinsky, kung saan ang RNA lamang ang nananatili sa aqueous phase, at ang DNA kasama ang mga protina ay pumasa sa organikong yugto. Ang Guanidine thiocyanate ay ginagamit bilang isang ahente na naghihiwalay at nagde-denatura ng mga cellular nucleases.

nagbibigay-daan upang makakuha ng mataas na purified RNA, libre mula sa DNA impurities;

nagbibigay ng kumpletong pagkuha ng RNA mula sa buong dugo, mga fragment ng tissue at mga kultura ng cell;

pinapayagan kang makakuha ng buo na RNA;

• Oras ng pagkuha ng RNA - 1 oras.

Lysing solution 30 cm 3 ,

Solusyon sa paghuhugas 1 30 cm 3 ,

Concentrate para sa solusyon sa paglilinis 2 20 cm 3 ,

Sorbent suspension 2 cm 3,

DNA elution buffer 4 cm 3 .

Mga dapat gawain:

Maghanda ng wash solution 2, para gawin ito, paghaluin ang 20 cm 3 ng concentrate mula sa kit, 80 cm 3 ng distilled water at 100 cm3 ng 96% na ethanol sa isang hiwalay na bote. Itago ang solusyon sa temperatura ng silid sa isang mahigpit na naka-screwed vial.

Suriin ang estado ng sorbent - kapag nag-aayos, dapat itong sakupin ang humigit-kumulang kalahati ng dami ng suspensyon.

Sa isang mahigpit na saradong 1.5 cm 3 polypropylene tube (mas mabuti na may takip ng tornilyo), magdagdag ng 100 µl ng dati nang inihanda na sample ng pagsubok, negatibo o positibo, magdagdag ng 300 µl ng lyse solution (sa bawat sample na may hiwalay na tip) at ihalo nang lubusan sa pamamagitan ng pipetting 3-10 beses.

Magdagdag ng 15 - 20 µl ng resuspended sorbent, ihalo nang mabuti sa isang vortex, ilagay sa isang rack para sa 5-7 minuto para sa kumpletong sedimentation ng sorbent.

Latak ang sorbent sa isang microcentrifuge sa loob ng 30 segundo sa 3-8 thousand rpm. Kunin ang supernatant mula sa bawat tubo na may hiwalay na tip (maginhawang gumamit ng vacuum suction).

Magdagdag ng 300 μl ng washing solution 1, ihalo sa isang vortex hanggang ang sorbent ay ganap na muling masuspinde (kung ang sorbent ay masira nang hindi maganda, basagin ito ng isang pipette), namuo sa isang centrifuge sa 4-8 thousand rpm sa loob ng 30 segundo. Alisin ang supernatant mula sa bawat tubo na may hiwalay na dulo.

Magdagdag ng 800 μl ng washing solution 2, ihalo sa isang vortex hanggang sa ganap na masuspinde ang sorbent, mag-precipitate sa isang microcentrifuge sa 6-10 thousand rpm para sa 30 sec, kunin ang supernatant.

Ulitin ang hakbang 6, maingat na piliin ang supernatant, tuyo ang sorbent precipitate sa isang thermostat sa 65°C sa loob ng 5 min.

Isuspinde muli ang sorbent sa 30–40 µl ng elution buffer, ilagay sa thermostat sa 65°C sa loob ng 5 min, pana-panahong pag-vortex.

Sediment sa isang microcentrifuge sa maximum na bilis ng 1 min.

Ang sample ay handa na para sa PCR, ang supernatant ay naglalaman ng purified DNA.

Bilang negatibong kontrol sa yugto ng pagkuha ng DNA, kinakailangang gumamit ng saline o deionized na tubig.

Ang kahusayan ng pagkuha ng DNA gamit ang DNA-sorb-PCR kit ay 30-60%.

5.2. Stage 2. PCR setup composition ng kit para sa PCR amplification:

5x reaction buffer. 1000 µl (viscous clear blue solution)

Deionized na tubig.2000 µl

Pinaghalong nucleotide.500 µl

Taq polymerase.100 µl

Primer mix.500 µl

Wax para sa PCR.2000 µl

Positibong kontrol. 100 µl

Negatibong kontrol 100 µl

Mineral na langis 4000 µl

Ang kit ay nakaimbak sa minus 20°C sa loob ng isang taon.