""DNA-sorb-S-M" ® AmpliSense FBUN Rospotrebnadzorin epidemiologian keskustutkimuslaitos, vain tutkimukseen Venäjän federaatio, 111123, ja muihin ei-lääketieteellisiin tarkoituksiin, Moskovan kaupunki, ..."

OHJEET

reagenssisarjan käytöstä

DNA:n erottamiseen biologisesta materiaalista

"DNA-sorb-S-M"

AmpliSense

FBUN Epidemiologian keskustutkimuslaitos

Rospotrebnadzor,

Vain tutkimuskäyttöön

Venäjän federaatio, 111123,

ja muihin ei-lääketieteellisiin tarkoituksiin

Moskova, Novogireevskaya-katu, 3A

LYHENNELISTA

TARKOITUS

MENETELMÄN PERIAATE

PAKKAUSLOMAKKEET

DNA:N UUTTAMINEN BIOLOGISESTA MATERIAALISTA ELÄIMISTÄ................................................. 8

PAINOSTUOTTEISSA KÄYTETYT SYMBOLIT

Lomake 1: REF К1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / sivu 2/15

LYHENNELISTA

Tässä oppaassa käytetään seuraavia lyhenteitä ja symboleja:

DNA - deoksiribonukleiinihappo NA - nukleiinihapot TC - negatiivinen uuttokontrolli NCO - negatiivinen kontrollinäyte PC - positiivinen uuttokontrolli PKO - positiivinen kontrollinäyte PCR - polymeraasiketjureaktio

– Liittovaltio valtion rahoittama organisaatio Tieteet

FBUN CRI

TARKOITUS

DNA-uutto on PCR-menetelmän esianalyyttinen menettely.

Näytteen tilavuus uuttamista varten: 100 µl (näytteet, joiden tilavuus on 10-100 µl tai paino 10-100 mg, voidaan testata)1.

HUOMIO! Tietoja keräysmenettelystä, testimateriaalin kuljetus- ja säilytysolosuhteista, sen DNA-uuttoa varten valmistelemisen tarpeesta ja menettelystä sekä tiedot häiritsevistä aineista ja näytteeseen liittyvistä rajoituksista löytyvät käytetyn amplifikaatioreagenssisarjan ohjeista. .

MENETELMÄN PERIAATE

Joidenkin biologisten materiaalien osalta vaaditaan näytteen valmistusvaihe. cm.

käytetyn amplifikaatioreagenssisarjan ohjeet.

Muoto 1: REF K1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / sivu 3/15 sentrifugoimalla ja sen jälkeen sorbentin pesulla. Kun eluutiopuskuri lisätään sorbenttiin, NC siirtyy piidioksidin pinnalta liuokseen, joka erotetaan sorbenttihiukkasista sentrifugoimalla. Tämän menettelyn tuloksena saadaan erittäin puhdas NA-valmiste, joka ei sisällä amplifikaatioreaktion estäjiä, mikä varmistaa PCR-tutkimuksen korkean analyyttisen herkkyyden.

PAKKAUSLOMAKKEET

Reagenssisarja on saatavana kahdessa kokoonpanossa:

Lomake 1 sisältää joukon reagensseja "DNA-sorb-S-M" versio 50.

Lomake 2 sisältää joukon reagensseja "DNA-sorb-S-M" version 100.

VAROTOIMET JA HÄVITTÄMISTIEDOT

Elintarvikkeita, biologisia lisäaineita, rehua tai kasvimateriaalia tutkittaessa työ on suoritettava vaatimusten mukaisesti ohjeita MU 1.3.2569-09 "Nukleiinihapon monistusmenetelmiä käyttävien laboratorioiden työn organisointi työskenneltäessä patogeenisyysryhmien I–IV mikro-organismeja sisältävän materiaalin kanssa" ja GOST R 53214-2008 "Elintarvikkeet. Analyysimenetelmät geneettisesti muunnettujen organismien ja niistä johdettujen tuotteiden havaitsemiseksi.

Yleiset vaatimukset ja määritelmät”.

Työskennellessäsi on aina noudatettava seuraavia vaatimuksia:

– Laboratorioprosessin tulee olla yksisuuntainen. Analyysi suoritetaan erillisissä huoneissa (vyöhykkeissä). Työn pitäisi alkaa uuttovyöhykkeellä ja jatkua vahvistus- ja tunnistusvyöhykkeellä. Älä palauta näytteitä, laitteita ja reagensseja alueelle, jossa edellinen prosessivaihe suoritettiin.

– Käyttämättömät reagenssit, vanhentuneet reagenssit ja muoto 1: REF K1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / sivu 4/15 käytettyä reagenssia, pakkaus3, biologinen materiaali, mukaan lukien materiaalit, instrumentit ja esineet, kontaminoitunut biologinen materiaali tulee hävittää SanPiN 2.1.7.2790-10 "Lääketieteellisen jätteen käsittelyn terveys- ja epidemiologiset vaatimukset" vaatimusten mukaisesti.

– Käytä ja vaihda jokaisen käyttökerran yhteydessä kertakäyttöisiä kärkiä automaattisille suodattimella varustetuille pipeteille4. Kertakäyttöinen muoviset astiat on hävitettävä erityiseen säiliöön, joka sisältää desinfiointiainetta, jota voidaan käyttää lääkejätteen puhdistamiseen.

– Näytteen valmistukseen käytetyt välineet (huhmarit ja survin) ja metalliset instrumentit (veitset, sakset, pinsetit, tehosekoitintarvikkeet jne.) säilytetään desinfiointiliuoksessa (esim. 0,2 % dikloori-isosyanuurihapon natriumsuolaliuos) tunnin ajan, pestään vesijohtovedellä pinta-aktiivisilla pesuaineilla ja juoksevan ja deionisoidun veden pesun jälkeen kuivattu kuivalla lämpökaapissa 4 tuntia 180 C:n lämpötilassa.

– Reagenssisarja on tarkoitettu kertakäyttöön määritellyn näytemäärän testaamiseen (katso kohta "Koostumus").

– Reagenssisarja on käyttövalmis näiden ohjeiden mukaisesti.

Käytä reagenssisarjaa vain sen aiottuun tarkoitukseen.

– Älä käytä reagenssisarjaa, jos sisäpakkaus on rikki tai ulkomuoto reagenssi ei vastaa kuvausta.

– Älä käytä reagenssisarjaa, jos ohjeiden mukaisia ​​kuljetus- ja säilytysolosuhteita ei ole noudatettu.

Käyttämättömät reagenssit, vanhentuneet reagenssit, käytetyt reagenssit, pakkaukset luokitellaan lääkejätteen vaaraluokkaan G.

Kertakäyttöisiä kärkiä ilman suodatinta käytetään supernatantin poistamiseen tyhjiöimulla tapahtuvan uuton aikana.

Lomake 1: REF К1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / sivu 5/15

– Älä käytä reagenssisarjaa sen viimeisen käyttöpäivän jälkeen.

– Käytä kertakäyttöisiä jauhettomia käsineitä, laboratoriotakkia ja silmäsuojaimia näytteitä ja reagensseja käsitellessäsi. Pese kädet huolellisesti työn päätyttyä. Kaikki toimenpiteet suoritetaan vain käsineillä, jotta vältetään kosketus ihmiskehoon.

– Vältä höyryjen hengittämistä, kosketusta iholle, silmiin ja limakalvoille, ei saa niellä. Jos ainetta joutuu kosketuksiin, huuhtele altistunut alue välittömästi vedellä; tarvittaessa hakeudu lääkärin hoitoon. sairaanhoito.

– Reagenssien käyttöturvallisuustiedotteet (SDS) ovat saatavilla pyynnöstä.

Arvio todennäköisistä tapahtumista, joiden seurauksena voi esiintyä kielteisiä seurauksia ihmiskeholle:

Kun sitä käytetään aiottuun tarkoitukseen ja edellä mainittuja varotoimenpiteitä noudattaen, kosketus ihmiskehoon on poissuljettu.

Hätätilanteissa on mahdollista:

- silmien limakalvojen ärsytys herkillä henkilöillä,

- ihoärsytys herkillä henkilöillä,

- allerginen reaktio,

- hengityksen aiheuttamat haitat,

- haittaa suun kautta otettuna.

Reagenssisarjan erityiset vaikutukset ihmiskehoon:

– Ei syöpää aiheuttavaa vaikutusta.

- Ei mutageenisia vaikutuksia.

– Ei lisääntymistoksisuutta.

LISÄMATERIAALIT JA LAITTEET

1. Kertakäyttöiset 1,5 ml:n ja 5,0 ml:n polypropeeniruuvit tai tiiviit tulppaputket (esim. Axygen, Inc.

(Exgen, Inc.), USA tai vastaava).

2. Kertakäyttöiset kärjet vaihtelevan tilavuuden pipeteille, joissa suodatin on enintään 200 ja enintään 1000 µl (esimerkiksi Axygen, Inc. ("Exgen, Inc."), USA tai vastaava).

3. Kertakäyttöiset kärjet vaihtelevan tilavuuden pipeteille 200 µl asti (esim. Axygen, Inc. ("Exgen, Inc."), USA tai vastaava).

Lomake 1: REF К1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / sivu 6/15

4. 1,5 ml:n putkitelineet (esimerkiksi Axygen, Inc. ("Exgen, Inc."), USA tai vastaava).

5. Laminaarilaatikko, biologinen turvallisuusluokka II tyyppi A (esim. "BAVp-01-"Laminar-S"-1.2", CJSC "Laminar Systems", Venäjä tai vastaava).

6. Termostaatti "Eppendorf"-tyyppisille putkille 25 - 100 °C (esim. SIA Biosan, Latvia tai vastaava).

7. Termostaatti-ravistin Eppendorf-tyyppisille putkille 25 - 100 °C (esim. TS-100, SIA Biosan, Latvia tai vastaava).

8. Mikrosentrifugi koeputkille tyyppi "Eppendorf". suurin nopeus sentrifugointi vähintään 12 tuhatta g (esimerkiksi MiniSpin, Eppendorf ("Eppendorf Manufacturing Corporation"), Manufacturing Corporation Germany tai vastaava).

9. Vortex (esim. SIA Biosan, Latvia tai vastaava).

10. Lääketieteellinen tyhjiöimuri, jossa on sulkupullo supernatantin poistamiseksi (esim. OM-1, OOO Utes, Venäjä tai vastaava).

11. Automaattiset annostelijat, joiden tilavuus vaihtelee (esim. Biohit LLC, Venäjä tai vastaava).

12. Jääkaappi 2 - 8 °С pakastin miinus 24 - miinus 16 C.

13. Erillinen aamutakki, lippalakit, kengät ja kertakäyttökäsineet MU 1.3.2569-09 mukaisesti.

14. Kertakäyttöinen muoviastiat materiaalien vapauttamiseen ja inaktivointiin.

–  –  –

DNA:N UUTTAMINEN ELÄIMISTÄ BIOLOGISESTA MATERIAALISTA

2. Valitse tarvittava määrä kertakäyttöisiä 1,5 ml:n polypropeeniputkia, joissa on kierrekorkit tai tiiviit korkit (mukaan lukien negatiiviset ja positiiviset uuttokontrollit, jos ne toimitetaan PCR-tutkimukseen).

Säilytettäessä lyysipuskuria ja pesuliuosta 1 2 - 8 °C:n lämpötilassa voi muodostua kiteiden muodossa olevaa sakkaa.

Lomake 1: REF К1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / sivu 8/15

3. Lisää 10 µl VKO6:ta jokaiseen putkeen (jos se toimitetaan PCR-testausta varten). Lisää putkiin 400 µl lyysipuskuria ja 17 µl lyysipuskuria.

4. Annostele 100 µl testinäytteitä6 valmistettuihin putkiin käyttämällä erillistä suodatinkärkeä jokaiselle näytteelle.

HUOMIO! Putkeen voidaan lisätä 400 µl lyse-puskuria ja 17 µl lyse-reagenssia, jossa on tarvittava määrä testinäytettä, ja 10 µl BKO7:ää (jos sellainen on PCR-tutkimusta varten) voidaan lisätä samaan putkeen käyttämällä erillisiä suodatinkärkiä.

5. Lisää 100 µl OKO:ta negatiivisen kontrollin (TC) uuttoputkeen, lisää 90 µl OKO:ta ja 10 µl FKO:ta positiivisen kontrollin (PC) uuttoputkeen (jos uuttokontrollit toimitetaan PCR-tutkimusten suorittamista varten).

6. Sulje kannet tiiviisti, sekoita huolellisesti ja sekoita tippoja vorteksilla.

Aseta putket termostaattiin 64 °C:seen 1 tunniksi vorteksoimalla säännöllisesti (5 kertaa 10–12 minuutin välein). Inkuboinnin annetaan 12 tuntia 60 °C:ssa.

7. Sedimentoi liukenemattomat näytepartikkelit sentrifugoimalla 5 minuuttia 10 kg:lla (esim. 12 krpm MiniSpin-mikrosentrifugille, Eppendorf Manufacturing Corporation).

8. Poista supernatantti 200-350 µl:n tilavuudessa erittäin varovasti (vältä suspendoituneiden hiukkasten ja rasvapisaroiden pääsyä sisään) erillisillä suodattimilla varustettujen kärkien avulla ja siirrä uusiin koeputkiin. Pisaroiden asettaminen pyörteeseen.

9. Suspendoi yleissorbentti uudelleen sekoittamalla voimakkaasti pyörteessä. Lisää 25 µl uudelleen suspendoitua yleissorbenttia jokaiseen putkeen erillisellä kärjellä, sulje kannet tiiviisti.

Vorteksoi, jätä telineeseen 10 minuutiksi sekoittaen 2 minuutin välein.

Testi- ja kontrollinäytteiden tilavuuden muuttaminen on sallittua, katso käytetyn amplifikaatioreagenssisarjan ohjeet.

Lomake 1: REF К1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / sivu 9/15

18. Toista pesuprosessi kappaleiden mukaisesti. 15–16, poista supernatantti kokonaan.

19. Aseta koeputket avoimilla kansilla termostaattiin 64 °C:ssa 5–10 minuutiksi yleissorbentin kuivaamiseksi.

20. Lisää 50–100 µl eluointipuskuria B putkiin (katso käytetyn amplifikaatioreagenssisarjan ohjeet).

Vorteksoi, kunnes sorbentti on täysin uudelleensuspendoitunut. Laita termostaattiin, jonka lämpötila on 64 °C, 5–10 minuutiksi, säännöllisin väliajoin (1 kerta minuutissa) sekoittaen pyörteessä.

Puhdistettua DNA:ta voidaan säilyttää 2–8 °C:n lämpötilassa viikon ajan, miinus 24–16 °C:n lämpötilassa 6 kuukautta ja enintään miinus 68 °C:n lämpötilassa vuoden. Tätä varten supernatantti on siirrettävä uuteen koeputkeen sieppaamatta sorbenttia.

Lomake 1: REF К1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / sivu 10/15

DNA:N UUTTAMINEN RUOKASTA, BIOLOGISISTA LISÄISTÄ,

ELÄINRUOKA TAI KASVIRUOKAA

1. Lämmitä lyysipuskuri ja pesuliuos 1, jos sitä säilytetään 2 - 8 °C:ssa, 64 °C:ssa, kunnes kiteet ovat täysin liuenneet.

2. Aseta 1,5 ml:n putket, joissa on esikäsiteltyjä testinäytteitä telineeseen (katso näytetilavuuden/määrän ohjeet käytetyn amplifikaatioreagenssisarjan ohjeista).

3. Valmistele kertakäyttöinen 1,5 ml:n polypropeeniputki, jossa on kierrekorkki tai tiukasti kiinnitettävä negatiivinen uuttokontrolli (EC). Lisää 100 µl OKO:ta koeputkeen.

4. Lisää 400 µl lyse-puskuria ja 17 µl lyse-reagenssia koeputkiin ja OC:ihin.

5. Sulje kannet tiiviisti, sekoita huolellisesti ja sekoita tippoja vorteksilla.

Aseta koeputket termostaattiin 64 °C:n lämpötilaan 1 tunniksi vorteksoimalla säännöllisesti (5 kertaa 10–12 minuutin välein) tai käytä termostaattiravistinta.

6. Sedimentoi liukenemattomat näytepartikkelit sentrifugoimalla 5 minuuttia 10 kg:lla (esim. 12 krpm MiniSpin-mikrosentrifugille, Eppendorf Manufacturing Corporation).

7. Valitse tarvittava määrä uusia kertakäyttöisiä 1,5 ml:n polypropeeniputkia, joissa on kierrekorkit tai tiiviit korkit.

8. Suspendoi yleissorbentti uudelleen sekoittamalla voimakkaasti pyörteessä. Lisää 25 µl uudelleen suspendoitua yleissorbenttia jokaiseen putkeen erillisellä kärjellä, sulje kannet tiiviisti.

9. Poista putkista, joissa on lysoituja näytteitä, supernatanttinestettä 200–350 µl:n tilavuudessa erittäin huolellisesti (välttäen suspendoituneiden hiukkasten ja rasvapisaroiden pääsyä sisään) käyttämällä erillisiä suodattimilla varustettuja kärkiä ja siirrä putkiin, joissa on sorbenttia. Vorteksoi, jätä telineeseen 10 minuutiksi sekoittaen 2 minuutin välein.

Lomake 1: REF К1-6-50-Mod / VER 27.12.16 / sivu 11/15

10. Sentrifugoi putkia mikrosentrifugissa 1 minuutin ajan 2 kg:lla (esim. 5 krpm MiniSpin-mikrosentrifugille, Eppendorf Manufacturing Corporation).

11. Ottamatta kiinni sorbentista, poista supernatantti kustakin putkesta erillisellä 200 µl:n kärjellä ilman suodatinta käyttämällä tyhjiöimuria.

12. Lisää 300 µl pesuliuosta 1 putkiin, sulje kannet tiukasti, sekoita, kunnes yleissorbentti on täysin suspendoitunut uudelleen.

13. Sentrifugoi putkia mikrosentrifugissa 1 minuutin ajan 2 000 g:ssä.

14. Ottamatta kiinni sorbentista, poista supernatantti kustakin putkesta erillisellä 200 µl:n kärjellä ilman suodatinta käyttämällä tyhjiöimuria.

15. Lisää 500 µl pesuliuosta 2 putkiin, sulje kannet tiukasti, sekoita pyörteessä, kunnes yleissorbentti on täysin suspendoitunut.

16. Sentrifugoi putkia mikrosentrifugissa 1 minuutin ajan 7 kg:lla (esim. 10 krpm MiniSpin-mikrosentrifugille, Eppendorf Manufacturing Corporation).

17. Tartumatta sorbenttiin, poista supernatantti kustakin putkesta erillisellä 200 µl:n kärjellä ilman suodatinta käyttämällä tyhjiöimuria.

18. Toista pesuprosessi kappaleiden mukaisesti. 15-16, poista supernatantti kokonaan.

19. Aseta koeputket avoimilla kansilla termostaattiin, jonka lämpötila on 64 °C, 5-10 minuutiksi universaalin sorbentin kuivaamiseksi.

20. Lisää putkiin 50 µl eluointipuskuria B. Vorteksoi, kunnes sorbentti on täysin uudelleensuspendoitunut. Laita termostaattiin, jonka lämpötila on 64 °C, 5–10 minuutiksi, säännöllisin väliajoin (1 kerta minuutissa) sekoittaen pyörteessä.

21. Sentrifugoi putkia mikrosentrifugissa 1 minuutin ajan 10 000 g:ssä. Supernatantti sisältää puhdistettua DNA:ta. Näytteet ovat valmiita PCR:ää varten.

Puhdistettua DNA:ta voidaan säilyttää 2 - 8 °C:n lämpötilassa viikon ajan, -24 - -16 °C:n lämpötilassa 6 kuukautta ja lämpötilassa Muoto 1: REF K1-6-50-Mod / VER 27.12 .16 / sivu 12/15 enintään miinus 68 °С vuoden aikana. Tätä varten supernatantti on siirrettävä uuteen koeputkeen sieppaamatta sorbenttia.

VIIMEINEN KÄYTTÖPÄIVÄMÄÄRÄ, KULJETUS- JA SÄILYTYSOLOSUHTEET.

Kuljetus. Joukko reagensseja tulee kuljettaa 2–8 C:n lämpötilassa enintään 5 päivän ajan lämpösäiliöissä, jotka sisältävät jääpakkauksia, kaikentyyppisissä peitettyinä. Ajoneuvo. Pura vastaanotettuasi määritettyjen säilytyslämpötilojen mukaisesti.

Varastointi. Säilytä reagenssipakkaus 2–25 C:n lämpötilassa lyse-reagenssia lukuun ottamatta. Säilytä lyysausreagenssi jääkaapissa 2–8 C:n lämpötilassa.

Kylmäkammioissa on oltava säädelty lämpötilajärjestelmä.

Nopea mikrokolonni-DNA-uuttomenetelmä on suunniteltu eristämään kokonais-DNA verestä, plasmasta, syljestä, virtsasta, soluviljelmistä ja kaikista puskurissa olevista solupelleteistä. Eristetyn DNA:n korkea puhtaus mahdollistaa sen käytön kaikentyyppisissä analyyseissä.

eristysaika on 30-45 minuuttia näytteiden lukumäärästä riippuen;

• DNA:n tehokas sitoutuminen pylvään kalvoon mahdollistaa suurimman DNA-saannon saamisen näytteestä;
• saavutetaan korkea puhdistusaste lyysaus- ja pesuliuosten komponenttien optimoidun koostumuksen ansiosta;
• vähensi merkittävästi DNA:n fragmentoitumista ja hävikkiä pesun aikana muihin sorbenttiuuttomenetelmiin verrattuna;
• on mahdollista suorittaa DNA:n konsentrointi vähentämällä eluutioliuoksen tilavuutta;
• DNA:n eristäminen kolonneissa vähentää merkittävästi ylimääräisen muovin kulutusta;
• suurin näytetilavuus - 200 µl;
• pakkaus sisältää proteinaasi K:n;
• eristetyn DNA:n puhtaus on 1,8-1,9 A260/A280-suhteen mukaan;
• eristetyn DNA:n määrä riippuu näytteen tyypistä ja määrästä. DNA:n saanto 200 µl:sta verta on keskimäärin 5-6 µg.

Reagenssisarja genomisen DNA:n uuttamiseen "DNA-Extran"

DNA-Extran-sarjan genomisen DNA:n uuttamiseen tarkoitettujen sarjojen avulla on mahdollista eristää DNA:ta erilaisista biologisista materiaaleista: verestä, bakteeri- ja eläinsoluviljelmistä, tuoreista, pakastetuista tai kuivatuista eläinten ja kasvien kudoksista.

• DNA:n täydellinen uuttaminen soluista minimoimalla DNA:n menetyksen ja fragmentoitumisen puhdistuksen aikana;
• eristetty DNA on korkeatasoinen puhtaus (suhde А260/А280 = 1,8-1,9) ja soveltuu PCR-, restriktio-, hybridisaatio- ja muihin tutkimuksiin;
• sarjat eivät sisällä mahdollisesti vaarallisia komponentteja, kuten fenolia ja kloroformia, eivät vaadi paljon muovia eivätkä aiheuta myrkyllistä jätettä.

Reagenssisarja DNA-uuttoon magneettisista hiukkasista "M-Sorb-Tub"

Mukautettu mykobakteeri-DNA:n eristämiseen ysköksestä, keuhkoputkien huuhtelunesteestä, aivo-selkäydinnesteestä, eritteestä, pisteestä, biopsiasta, virtsasta, sukuelinten eritteistä, soluviljelmistä. Kliinisen materiaalin esikäsittely suoritetaan mikrobiologisissa tutkimuksissa näytteiden valmistelua koskevien standardimenettelyjen mukaisesti (Venäjän federaation terveysministeriön määräys nro 109, 21. maaliskuuta 2003 "Parannuksista" Venäjän federaatio”, Liite 11 ”Ohje mikrobiologisen tutkimuksen yhtenäisistä menetelmistä tuberkuloosin havaitsemisessa, diagnosoinnissa ja hoidossa”). Kliinisen materiaalin inaktivoimiseksi suosittelemme käyttämään inaktivoivaa ratkaisuamme A.

Liuos A tappaa mykobakteerit 12 tunnin kuluessa ja desinfioi kliinisen materiaalin, jota voidaan käyttää jatkoanalyyseihin (DNA-uutto, PCR jne.). Liuos A on sovitettu erityisesti ysköksen hoitoon ja korvaa täysin NaOH-NALC-liuosta käyttävän tavanomaisen menetelmän, sillä on poikkeukselliset mukolyyttiset ominaisuudet. Inaktivointiliuos A lisää DNA:n saantoa verrattuna tavalliseen NaOH-NALC-näytteen valmisteluun.

Eristysmenettely sisältää: DNA-lyysin guanidiini-isotiosyanaatilla, DNA:n sorption magneettisilla partikkeleilla, DNA:n sedimentoinnin sentrifugoimalla, pesuvaiheet ja DNA-eluoinnin. Voidaan käyttää muiden mikro-organismien DNA:n eristämiseen.

silikageelillä päällystettyjen magneettisten hiukkasten käyttö sorbenttina on teknisesti edistyneempi ja kätevämpi muoto verrattuna muihin sorbentteihin; se mahdollistaa DNA-uuttomenettelyn maksimaalisen standardoinnin ja automatisoinnin;

sisäinen positiivinen kontrolli (IPC) lisätään jokaiseen testinäytteeseen, RT-PCR-estäjien läsnäolo/puuttuminen ja DNA:n uuton tehokkuus arvioidaan IPC-amplifikaatioreaktion perusteella.

Reagenssisarjat DNA:n erottamiseen elintarvikkeista ja elintarvikeraaka-aineista

Reagenssisarjat "Sorb-GMO-A" ja "Sorb-GMO-B" on suunniteltu erityisesti DNA:n erottamiseen kasvimateriaaleista, elintarvikkeista ja rehuista. Molemmissa DNA-puhdistuspakkauksissa käytetään piisorbenttia. "Sorb-GMO-A" sisältää guanidiinikloridia hajottavana aineena, "Sorb-GMO-B" sisältää ionista STAB-detergenttiä, joka tarjoaa maksimaalisen DNA-saannon kasvikomponenteista. Erottuvia piirteitä"Sorb-GMO-A" -sarjan ominaisuudet ovat DNA:n uuttamisen nopeus ja kloroformin puuttuminen, mikä tekee työskentelystä pakkauksen kanssa turvallisempaa.

Reagenssisarja DNA-uuttoon vesinäytteistä (magneettisilla hiukkasilla) "M-Sorb-Leg"

Suunniteltu eristämään Legionella DNA:ta vesistöistä ympäristöön(jäähdytystornit, uima-altaat, vesipuistot, kuuman ja kylmän veden syöttöjärjestelmät). Pienin talteenotettu Legionella-pitoisuus on 100 solua 0,5 litraa näytettä kohti.

"M-Sorb-Leg" -sarjaa valmistetaan kahdessa versiossa: "M-Sorb-Leg1000" vesinäytteille, joiden tilavuus on 1-1000 ml, ja "M-Sorb-Leg1" vesinäytteille, joiden tilavuus on enintään 1 ml. M-Sorb-Leg1000-sarja tarjoaa veden suodatuksen polykarbonaattisuodattimella.

reagenssisarja "M-Sorb-Leg" antaa sinun päästä eroon erittäin saastuneissa vesinäytteissä olevista PCR-estäjistä;

• DNA:n eristystekniikka perustuu DNA:n sorptioon silikageelillä päällystetyillä magneettihiukkasilla, jota seuraa saostus saostusreagenssilla. Yhdistää sorptiomenetelmien ja kokonaissaostusmenetelmän edut;
• sisäinen positiivinen kontrolli (IPC) lisätään jokaiseen testinäytteeseen, ja RT-PCR-inhibiittoreiden läsnäolo/puuttuminen arvioidaan IPC-amplifikaatioreaktion perusteella.

Sarja reagensseja DNA:n erottamiseen ympäristön kohteista (magneettisilla hiukkasilla) "M-Sorb-OOM"

M-Sorb-OOM-reagenssisarja on suunniteltu eristämään DNA ympäristön esineistä (maaperä, vesi, eläinten ruumiit jne.), joiden epäillään olevan erittäin vaarallisten mikro-organismien (OOM) saastuttamia, jotta ne voidaan valmistaa myöhempää analyysiä varten todellisella aika PCR. Uuttomenettely on samanlainen kuin M-Sorb-Leg -sarjalle kuvattu.

Reagenssipakkaus RNA-eristykseen "RNA-Extran"

Sarja on tarkoitettu RNA:n eristämiseen verestä, kudosfragmenteista ja soluviljelmistä. RNA-Extran-pakkauksella saatua RNA:ta voidaan käyttää sekä RT-PCR:ssä että hybridisaatioanalyysissä, in vitro -translaatiossa ja kloonauksessa.

RNA:n eristyksen periaate perustuu Chomchinskyn mukaan happamaan fenoliuuttoon, jossa vesifaasiin jää vain RNA ja DNA yhdessä proteiinien kanssa siirtyy orgaaniseen faasiin. Guanidiinitiosyanaattia käytetään aineena, joka eristää ja denaturoi solun nukleaaseja.

mahdollistaa erittäin puhdistetun RNA:n saamisen, joka on vapaa DNA-epäpuhtauksista;

tarjoaa täydellisen RNA:n uuttamisen kokoverestä, kudosfragmenteista ja soluviljelmistä;

antaa sinun saada ehjän RNA:n;

• RNA:n uuttoaika - 1 tunti.

Lyysiliuos 30 cm 3 ,

Pesuliuos 1 30 cm 3 ,

Konsentraatti puhdistusliuokseen 2 20 cm 3 ,

Sorbenttisuspensio 2 cm 3,

DNA-eluointipuskuri 4 cm3.

Käyttömenettely:

Valmista pesuliuos 2, sekoita tätä varten 20 cm 3 sarjan konsentraattia, 80 cm 3 tislattua vettä ja 100 cm 3 96 % etanolia erillisessä pullossa. Säilytä liuos huoneenlämmössä tiukasti kierretyssä injektiopullossa.

Tarkista sorbentin tila - laskeutuessaan sen tulisi olla noin puolet suspension tilavuudesta.

Lisää tiiviisti suljettuun 1,5 cm 3:n polypropeeniputkeen (mieluiten kierrekorkilla) 100 µl aiemmin valmistettua testinäytettä, negatiivista tai positiivista, lisää 300 µl lyse-liuosta (kuhunkin näytteeseen erillisellä kärjellä) ja sekoita huolellisesti pipetointi 3-10 kertaa.

Lisää 15 - 20 µl uudelleen suspendoitua sorbenttia, sekoita hyvin pyörteessä, laita telineeseen 5-7 minuutiksi sorbentin täydelliseen sedimentoitumiseen.

Sedimentoi sorbentti mikrosentrifugissa 30 sekunnin ajan nopeudella 3-8 tuhatta rpm. Ota supernatantti jokaisesta putkesta erillisellä kärjellä (on kätevä käyttää tyhjiöimua).

Lisätään 300 μl pesuliuosta 1, sekoitetaan pyörteellä, kunnes sorbentti on täysin uudelleensuspendoitunut (jos sorbentti hajoaa huonosti, riko se pipetillä), saostetaan sentrifugissa nopeudella 4-8 tuhat rpm 30 sekuntia. Vedä supernatantti jokaisesta putkesta erillisellä kärjellä.

Lisää 800 μl pesuliuosta 2, sekoita pyörteessä, kunnes sorbentti on täysin uudelleen suspendoitunut, saosta mikrosentrifugilla 6-10 000 rpm 30 sekunnin ajan, ota supernatantti.

Toista vaihe 6, valitse supernatantti huolellisesti, kuivaa sorbenttisakka termostaatissa 65 °C:ssa 5 minuuttia.

Suspendoi sorbentti uudelleen 30–40 µl:aan eluointipuskuria, aseta termostaattiin 65 °C:seen 5 minuutiksi sekoittaen säännöllisesti vorteksoimalla.

Sedimentoi mikrosentrifugiin enintään 1 minuutin nopeudella.

Näyte on valmis PCR:ää varten, supernatantti sisältää puhdistettua DNA:ta.

Negatiivisena kontrollina DNA-uuttovaiheessa on tarpeen käyttää suolaliuosta tai deionisoitua vettä.

DNA-uuton tehokkuus DNA-sorb-PCR-sarjalla on 30–60 %.

5.2. Vaihe 2. PCR-monistussarjan PCR-asetuskoostumus:

5x reaktiopuskuri. 1000 µl (viskoosi kirkas sininen liuos)

Deionisoitu vesi.2000 µl

Nukleotidisos.500 µl

Taq-polymeraasi.100 µl

Pohjasekoitus.500 µl

Vaha PCR:ää varten.2000 µl

Positiivinen kontrolli 100 µl

Negatiivinen kontrolli 100 µl

Mineraaliöljy 4000 µl

Sarjaa säilytetään miinus 20°C:ssa vuoden ajan.