Métodos de obtención de colonias aisladas de aerobios. Instrucciones metódicas. Un cultivo puro de microbios es una población de microorganismos de una especie obtenida de una colonia microbiana aislada. III. plan de trabajo practico

Método de siembra de líneas Hoy en día se utiliza con mayor frecuencia en los laboratorios de microbiología. El material que contiene microorganismos se recoge con un asa bacteriológica y se aplica a la superficie del medio nutritivo cerca del borde del plato. Retire el exceso de material y aplíquelo con movimientos paralelos de borde a borde de la copa. Después de un día de incubación de los cultivos a la temperatura óptima, crecen colonias aisladas de microbios en la superficie de la placa.

método de trazo

Para obtener colonias aisladas, puede utilizar un hisopo utilizado para recolectar el material de prueba. Abra ligeramente la placa de Petri con el medio nutritivo, inserte un tampón en ella y frote con cuidado el material en la superficie de la placa, devolviendo gradualmente el tampón y la placa.

Por lo tanto, una ventaja significativa de los métodos de cultivo en rayas y dilución en placas de Koch, Drigalski es que crean colonias aisladas de microorganismos que, cuando se inoculan en otro medio nutritivo, se convierten en un cultivo puro.

Aislamiento de cultivo puro de microorganismos aeróbicos. consta de una serie de etapas.

Primer día (Etapa 1 del estudio) El material patológico se recoge en un recipiente estéril (tubo de ensayo, matraz, botella). Se estudia por su apariencia, consistencia, color, olor y otras características, se prepara un frotis, se pinta y se examina al microscopio. En algunos casos (gonorrea aguda, peste), en esta etapa es posible realizar un diagnóstico previo, y además seleccionar el medio sobre el que se inoculará el material. La ocupación se realiza con un asa bacteriológica (el más utilizado), utilizando una espátula según el método Drigalsky y un hisopo de gasa de algodón. Las tazas se cierran, se les da la vuelta, se firman con un lápiz especial y se colocan en un termostato a la temperatura óptima (37 ° C) durante 18-48 años. El objetivo de esta etapa es la obtención de colonias aisladas de microorganismos.

Sin embargo, a veces, para acumular material, se siembra en medios nutritivos líquidos.

En el segundo día (Etapa 2 del estudio) En la superficie de un medio nutritivo denso, los microorganismos forman un crecimiento denso y continuo o colonias aisladas. La colonia– son acumulaciones de bacterias visibles a simple vista en la superficie o en el espesor del medio nutritivo. Como regla general, cada colonia se forma a partir de los descendientes de una célula microbiana (clones), por lo que su composición es bastante homogénea. Las características de crecimiento de las bacterias en medios nutritivos son una manifestación de sus propiedades culturales.

Las placas se examinan cuidadosamente y se estudian las colonias aisladas que han crecido en la superficie del agar. Preste atención al tamaño, forma, color, naturaleza de los bordes y superficie de las colonias, su consistencia y otras características. Si es necesario, examine las colonias con una lupa o un microscopio de bajo o alto aumento. La estructura de las colonias se examina con luz transmitida y con un microscopio de bajo aumento. Pueden ser hialinos, granulares, filiformes o fibrosos, que se caracterizan por la presencia de hilos entrelazados en el espesor de las colonias.

Las características de las colonias son una parte importante del trabajo de un bacteriólogo y asistente de laboratorio, porque los microorganismos de cada especie tienen sus propias colonias especiales.

Las colonias se pueden caracterizar por diferentes características. Según su tamaño (diámetro), se dividen en grandes (4-6 mm y más), medianos (2-4 mm), pequeños (1-2 mm), enanos o puntiagudos (menos de 1 mm). La forma de las colonias puede ser muy diversa: regularmente redonda, irregular (parecida a una ameba), rizoide. Pueden ser transparentes, dejando pasar la luz, o turbias.

Detrás del relieve y el contorno de la forma en una sección vertical, las colonias se dividen en planas, convexas, en forma de cúpula, en forma de puntos, en forma de cono, en forma de plano, planas, que se extienden a lo largo de la superficie del medio, con un centro deprimido, con un centro en forma de pezón.

La superficie de las colonias puede ser mate o brillante, lustrosa, seca o húmeda, lisa y brillante o rugosa. Las colonias lisas y brillantes se denominan formas S (lisas, lisas y brillantes) y las rugosas, formas R (rugosas, rugosas, desiguales).

La forma de las superficies rugosas también puede variar: arrugadas, giróticas, verrugosas, peludas, con estrías radiales y similares.

La gran mayoría de microorganismos forman colonias incoloras o lechosas. Sin embargo, algunos de ellos forman colonias de colores. Su color viene determinado por el pigmento que sintetizan las bacterias: blanco, crema, amarillo, dorado, azul, rojo, etc.

Al tocar una colonia con un asa, se puede determinar su consistencia: pastosa, viscosa o viscosa, seca, quebradiza, etc.

Se preparan frotis a partir de colonias sospechosas, se tiñen mediante el método de Gram para estudiar las propiedades morfológicas y tintoriales de los patógenos y se examinan las bacterias móviles en una gota "colgante" o "triturada". Estos signos tienen un valor diagnóstico extremadamente grande a la hora de caracterizar ciertos tipos de microorganismos.

Los restos de las colonias en estudio se retiran cuidadosamente de la superficie del medio, sin tocar otras, y se inoculan en placas de agar o en sectores de una placa de Petri con un medio nutritivo para obtener un cultivo puro. Los tubos de ensayo o tazas con cultivos se colocan en un termostato a la temperatura óptima durante 18 a 24 años.

Hoy en día, por regla general, los bacteriólogos intentan utilizar medios nutritivos secos estándar producidos por la industria microbiológica. Estos entornos pueden mejorar significativamente los resultados de los estudios microbiológicos y estandarizarlos.

Las bacterias también pueden crecer de manera diferente en medios nutritivos líquidos, aunque las características de las manifestaciones de crecimiento son peores que en medios sólidos.

Las bacterias son capaces de provocar una turbidez difusa del medio, su color puede no cambiar o adquirir el color de un pigmento. Este patrón de crecimiento se observa con mayor frecuencia en la mayoría de los microorganismos anaeróbicos facultativos.

A veces se forma un precipitado en el fondo del tubo de ensayo. Puede ser quebradizo, homogéneo, viscoso, mucoso, etc. El medio que se encuentra encima puede permanecer transparente o volverse turbio. Si los microbios no forman pigmento, el sedimento tiene un color azul azulado o amarillento. Por regla general, las bacterias anaeróbicas crecen de manera similar.

El crecimiento parietal se manifiesta por la formación de escamas y granos adheridos a las paredes internas del tubo de ensayo. El medio permanece transparente.

Las bacterias aeróbicas tienden a crecer superficialmente. A menudo se forma una película delicada, incolora o azulada en forma de una capa apenas perceptible en la superficie, que desaparece cuando se agita o agita el medio. La película puede estar húmeda, espesa, tener una consistencia fibrosa y viscosa y pegarse al bucle, tirando hacia atrás. Sin embargo, también se presenta una película densa, seca y quebradiza, cuyo color depende del pigmento producido por los microorganismos.

Si es necesario, se hace un frotis, se tiñe, se examina bajo un microscopio y se inoculan microorganismos con un asa en la superficie de un medio nutritivo sólido para obtener colonias aisladas.

En el tercer dia (Etapa 3 del estudio) Estudiar el patrón de crecimiento de un cultivo puro de microorganismos y realizar su identificación.

Primero, prestan atención a las características del crecimiento de los microorganismos en el medio y hacen un frotis, tiñéndolo según el método de Gram, para comprobar la pureza del cultivo. Si se observan al microscopio bacterias del mismo tipo de morfología, tamaño y propiedades tintoriales (capacidad de teñir), se concluye que el cultivo es puro. En algunos casos, basándose en la apariencia y características de su crecimiento, se puede sacar una conclusión sobre el tipo de patógenos aislados. La determinación de las especies de bacterias en función de sus características morfológicas se denomina identificación morfológica. La determinación del tipo de patógeno en función de sus características culturales se denomina identificación cultural.

Sin embargo, estos estudios no son suficientes para llegar a una conclusión definitiva sobre el tipo de microbios aislados. Por tanto, se estudian las propiedades bioquímicas de las bacterias. Son bastante diversos.

Muy a menudo, se estudian las propiedades sacarolíticas, proteolíticas, peptolíticas, hemolíticas, la formación de enzimas descarboxilasas, oxidasa, catalasa, plasmacoagulasa, ADNasa, fibrinolisina, reducción de nitratos a nitritos y similares. Para ello existen medios nutritivos especiales en los que se inoculan microorganismos (serie Hiss variada, MPB, suero cuajado, leche, etc.).

Recuerde los pasos para aislar cultivos puros de bacterias aeróbicas:

1 - examen macro y microscópico del material en estudio e inoculación en medios nutritivos sólidos para obtener colonias aisladas.

2 - examen macro y microscópico de las colonias y resiembra en agar inclinado para obtener un cultivo puro;

3 - comprobar la pureza del cultivo y su identificación;

4 - conclusión sobre la cultura seleccionada.

9. Métodos de cultivo e identificación de anaerobios. Aislamiento de un cultivo puro de bacterias anaeróbicas.

Todos los microorganismos según el tipo de respiración se dividen en dos grupos principales: Aerobni (Corynebacterium diphtheriae, Vibrio сholerae y similares) Y anaeróbicos (Clostridium tetani, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, etc.). Si el material del que se van a aislar los patógenos anaeróbicos se precalienta y luego se cultiva en condiciones anaeróbicas, entonces estas bacterias crecerán.

Aislamiento de un cultivo puro de bacterias anaeróbicas.

En la práctica de laboratorio, a menudo será necesario trabajar con microorganismos anaeróbicos. Son más exigentes con los medios nutritivos que los aerobios, requieren con mayor frecuencia aditivos de crecimiento especiales, requieren el cese del acceso de oxígeno durante su cultivo y su duración de crecimiento es más larga. Por tanto, trabajar con ellos es más complejo y requiere una mayor atención por parte de bacteriólogos y técnicos de laboratorio.

Es importante proteger el material que contiene patógenos anaeróbicos de los efectos tóxicos del oxígeno atmosférico. Por lo tanto, se recomienda tomar material de los focos de infección purulenta durante la punción con una jeringa, el tiempo entre la toma del material y su inoculación en un medio nutritivo debe ser lo más corto posible.

Dado que para el cultivo de bacterias anaeróbicas se utilizan medios nutritivos especiales, que no deben contener oxígeno y tener un potencial redox bajo (-20 -150 mV), se añaden a su composición indicadores: resazurina, azul de metileno, etc., que reaccionan ante un cambio. en este potencial. A medida que crece, las formas incoloras de los indicadores se restauran y cambian de color: la resazurina se vuelve rosa medio y el azul de metileno se vuelve azul medio. Tales cambios indican la imposibilidad de utilizar medios para el cultivo de microbios anaeróbicos.

La introducción de al menos un 0,05% de agar en el medio ayuda a reducir el potencial redox, lo que, al aumentar su viscosidad, ayuda a reducir el suministro de oxígeno. Esto, a su vez, también se consigue utilizando medios frescos (a más tardar dos horas después de la producción) y medios con nutrientes reducidos.

Hay que tener en cuenta que debido a las peculiaridades del metabolismo de tipo fermentativo de las bacterias anaeróbicas, requieren ambientes más ricos en componentes nutricionales y vitaminas. Los más utilizados son las infusiones de corazón, cerebro y hígado, extractos de soja y levadura, digestiones hidrolíticas de caseína, peptona y triptona. Es obligatorio añadir factores de crecimiento como Tween-80, hemina, menadiona, sangre entera o hemolizada.

Métodos para crear condiciones anaeróbicas. Teniendo en cuenta que el oxígeno molecular libre es tóxico para las bacterias anaeróbicas obligadas, una condición obligatoria para el cultivo de dichos microorganismos es limitar su acceso. Existen varios métodos (mecánicos, físicos, biológicos) que pueden garantizarlo.

Métodos físicos. 1. Antes de inocular bacterias en un medio nutritivo, éste debe regenerarse para eliminar el exceso de oxígeno disuelto. Para ello, el medio se hierve durante 15 a 20 minutos en un baño de agua y luego se enfría rápidamente a la temperatura requerida.

2. Para evitar la penetración de oxígeno en el medio, se rellena con una capa de vaselina o parafina estéril.

3. La columna de medio nutritivo en los tubos de ensayo debe ser lo suficientemente alta (10-12 cm). El oxígeno, por regla general, se difunde en la columna a una profundidad de 2 cm, por lo que debajo se crean condiciones favorables para el cultivo de microbios anaeróbicos.

4. El método de sustitución de la evacuación consiste en utilizar anaerostatos. Son latas de metal o plástico herméticamente cerradas de las que se puede bombear oxígeno y sustituirlo por un gas inerte (helio, nitrógeno, argón). Se permite utilizar una mezcla de gases de tres componentes, que consta de 80% de nitrógeno, 10% de dióxido de carbono y 10% de hidrógeno. En ocasiones se considera aceptable el uso de gas natural. Para absorber el oxígeno que queda en el anaerostato se utilizan catalizadores de paladio. Para absorber el vapor de agua se utilizan cloruro de calcio, gel de sílice y similares, que se colocan en el fondo del anaerostato.

Métodos químicos. 1. Uso de sustancias capaces de absorber oxígeno. Para ello, es aceptable utilizar una solución alcalina de pirogalol. En este caso, se tiene en cuenta la actividad de absorción de la sustancia: por 100 ml de la capacidad del recipiente sellado en el que se encuentran las placas de Petri, se utilizan 1 g de pirogalol y 10 ml de solución de hidróxido de sodio 2,5 N.

El hidrosulfito de sodio (Na2S2O4) también tiene un efecto de unión al oxígeno. Para unir el oxígeno en 1 litro de aire, utilice una mezcla que consta de 100 ml de solución fresca de Na2S2O4 al 20% y 16 ml de hidróxido de potasio al 50%.

2. Uso de sustancias reductoras. Teniendo en cuenta que el crecimiento de bacterias anaeróbicas obligadas se produce en ambientes con un bajo nivel de potencial redox, se les añaden agentes reductores especiales: cisteína (0,03-0,0,5%), ácido tioglicólico o tioglicolato de sodio (0,01-0,02). %), sulfuro de sodio, ácido ascórbico (0,1%), azúcares diversos.

Las funciones de renovadores pueden ser realizadas por trozos de órganos parenquimatosos de animales (hígado, riñones, corazón) o incluso de plantas (patatas, otros tubérculos).

El grado de absorción de oxígeno o el grado de renovación del medio se mide electrométricamente o mediante indicadores (resazurina, rojo neutro, fenosafranina).

3. El uso de sistemas especiales de generación de gas que permitan crear condiciones libres de oxígeno en microaeronstatos, bolsas de plástico para el transporte y similares. Uno de los más comunes es el sistema “Caja Generadora de Gas”. Contiene generadores químicos de hidrógeno (borohidrita de sodio) y dióxido de carbono (tabletas de bicarbonato de sodio y ácido cítrico), así como un catalizador de paladio que absorbe oxígeno.

Las cápsulas con las inoculaciones se colocan en un microaerobato, en cuyo fondo hay una capa de catalizador de paladio. La punta del paquete "Caja generadora de gas" se corta con unas tijeras y se vierten en él entre 10 y 15 ml de agua. El paquete se coloca en un microaerostato. Después de 15 a 20 minutos, se crean condiciones anaeróbicas. El hidrógeno que se libera reacciona con el oxígeno para formar agua y se produce dióxido de carbono cuando el bicarbonato de sodio reacciona con el ácido cítrico.

Métodos biológicos. 1. Método de Fortner. El método consiste en cocultivar microorganismos aeróbicos y anaeróbicos en un mismo medio. En primer lugar, a lo largo del diámetro del plato se corta una tira de agar de hasta 0,5-1,0 cm de ancho, en un lado se inocula el material de prueba, que contiene patógenos anaeróbicos, y microbios que son un indicador de las condiciones anaeróbicas (Serratia marcescens o “palo maravilloso”) se inoculan por el otro lado. Los bordes de la taza se enceran o se cubren con plastilina. Después de algún tiempo, crecen colonias de microbios aeróbicos y anaeróbicos en la superficie del medio. Cuando Serratia marcescens absorbe oxígeno, produce colonias de color rosa pálido o incoloras, y cuando la foca se daña, produce colonias de color rojo brillante. En la otra mitad de la copa crecen colonias de microbios anaeróbicos.

2. Método Hennel (“gafas de reloj”). Es una especie de modificación del anterior. El material que contiene patógenos anaeróbicos se siembra en la superficie de un medio nutritivo de 2 a 2,5 cm de diámetro, se cubre encima con un “vidrio de reloj”, se rellena con una capa de MPA y se sembra con Serratia marcescens. Los microbios aeróbicos, al absorber oxígeno, crean las condiciones para el crecimiento favorable de patógenos anaeróbicos.

En laboratorios altamente especializados se utiliza una tecnología anaeróbica especial, que incluye el uso de medios nutritivos sin oxígeno con agentes renovadores, realizando inoculaciones y subcultivos en una atmósfera de gases inertes, dióxido de carbono y similares.

En los últimos años se han creado cajas anaeróbicas estacionarias que contienen todo lo necesario para crear condiciones de cultivo anaeróbicas, incluidos termostatos. Como regla general, estas cámaras se llenan con una mezcla de gases de tres componentes. El bacteriólogo trabaja en la cámara desde el exterior, utilizando guantes de goma integrados en ella. Este tipo de equipo tiene ventajas irrefutables, que consisten en que se elimina por completo el contacto del oxígeno con el material en estudio.

Aislamiento e identificación de microorganismos anaeróbicos.

Teniendo en cuenta el desarrollo moderno de la ciencia microbiológica, es posible aislar e identificar cultivos de microorganismos anaeróbicos de forma similar a las bacterias aeróbicas. Es obligatorio cumplir con las condiciones de anaerobiosis en todas las etapas del estudio, utilizando una mezcla de gases de tres componentes (nitrógeno, hidrógeno y dióxido de carbono en una proporción determinada) o el sistema “Caja Generadora de Gas”.

Sin embargo, los agentes causantes del tétanos, el botulismo y la infección por anaeróbicos gaseosos se pueden aislar e identificar mediante un esquema diferente.

En la primera etapa (y el día del estudio) se estudian las características macroscópicas del material clínico, se realiza un frotis y se tiñe mediante el método de Gram. Después de esto, el material se inocula en medio Kitta-Tarozzi y leche. Primero se regenera el medio en un baño de agua hirviendo durante 10 a 20 minutos y se enfría. Inmediatamente después de inocular el material, el medio se calienta en un baño de agua a 80°C durante 20 minutos para destruir las formas vegetativas de microbios que no son esporas. Los medios se colocan en un termostato y se cultivan a una temperatura de 37 °C durante 1 a 3 días.

En la segunda etapa se estudian las manifestaciones del crecimiento microbiano (turbidez, formación de sedimentos y gases en el medio Kitta-tarozzi, peptonización de la leche). Dado que el medio Kitta-tarozzi se llena con una capa de aceite de vaselina en la parte superior para evitar el acceso de oxígeno, se sumerge en él una pipeta Pasteur, se recoge el líquido, del cual se prepara un frotis, tiñéndolo mediante el método de Gram. Bajo el microscopio, en el frotis se pueden ver grandes bacterias grampositivas en forma de bastoncillos. Posteriormente se toma el material mediante los métodos de Weinberg o Zeissler para obtener colonias aisladas.

Siguiendo el método Weinberg, prepare varios tubos de ensayo estrechos y altos (3-4) con agar de peptona de carne de azúcar derretido y enfriado a 42-45 °C. Es posible utilizar medio Wilson-Blair. El material del medio Kitta-tarozzi se añade al primer tubo de ensayo con una pipeta Pasteur y se mezcla bien, luego se transfiere a otro y luego al tercero. Para endurecer el agar, enfríelo rápidamente con agua fría del grifo. Gracias a esto, las células microbianas vivas se fijan en determinadas zonas del agar. Una vez que el agar se endurece, los tubos se cultivan a la temperatura óptima durante 1 o 2 días para formar colonias aisladas.

Colonias según Weinberg

El contenido de cada tubo también se puede aspirar con pipetas Pasteur o tubos Vignal-Veylon, asegurándose de que no queden burbujas de aire. Estos últimos tienen una longitud de unos 30 cm y un diámetro de 0,5-0,6 cm, su extremo superior, cubierto con algodón, tiene una constricción y el inferior se alarga en forma de capilar. Después de llenar la pipeta, se sella su extremo extendido y se coloca en un termostato para cultivo. Después de 1 o 2 días, crecen colonias de bacterias anaeróbicas en el agar. Para aislarlos se corta el tubo con una lima a cierta altura, se rompe, se toma la colonia con un asa o aguja bacteriana y se transfiere al medio adecuado.

Para aislar colonias aisladas mediante el método Zeissler, se aplica material del medio Kitta-tarozzi o leche con un asa o 1-2 gotas con una pipeta Pasteur en una placa de Petri con agar sangre-azúcar y se inocula con una espátula mediante el método Drygalsky. . Sin esterilizar la espátula, inocular la segunda copa y luego la tercera. Las tazas se voltean, se etiquetan, se coloca un vanaerostato en el que se crean condiciones anaeróbicas y luego se colocan en un termostato a una temperatura de 37 ° C durante 2-3 días. En la última placa crecen colonias aisladas.

La tercera etapa del estudio comienza con el estudio de las características morfológicas de las colonias que crecieron en placas de Petri o tubos de Vignal-veillon. Se examina su forma, tamaño, color, carácter de los bordes, relieve de la colonia, consistencia, etc. Se preparan frotis a partir de las colonias y se tiñen mediante el método de Gram. Después de esto, las colonias se tamizan en medio Kitta-Tarozzi para obtener un cultivo puro. Los cultivos se incuban durante un tiempo determinado a la temperatura óptima.

En la cuarta etapa, se presta atención a las características de crecimiento de un cultivo puro de patógenos en los medios adecuados, se comprueba su pureza y se lleva a cabo la identificación. Los cultivos puros aislados de microorganismos anaeróbicos, similares a los microorganismos aeróbicos, se identifican por características morfológicas, culturales, bioquímicas y biológicas. Es imperativo utilizar la determinación de las propiedades toxigénicas de patógenos en una muestra biológica y reacciones de neutralización en animales de laboratorio. En algunos casos, se determinan las propiedades antigénicas de los microorganismos.

Así, a partir del estudio de las diversas propiedades de los microorganismos, se llega a una conclusión sobre su pertenencia a una u otra especie.

Medios para el cultivo de microorganismos anaeróbicos.

El medio Kitta-Tarozzi se prepara a base de caldo Hottinger, al que se le añaden trozos de hígado o carne de vacuno. Esterilízalo a 1 atmósfera durante 30 minutos. La reacción activa del medio ambiente es 7,4-7,6. Después de sembrar el material, se vierte encima el medio con una capa de aceite de vaselina de hasta 1 cm de espesor.

El agar sangre anaeróbico se prepara a partir de agar eritritol. También contiene aditivos especiales: medio 199 (10%), hemina (10 mcg/ml), Tween-80 (0,1%), metadiona (10 mcg/ml), citrato de sangre (hasta un 5%) y similares. Después de la esterilización, se vierte en placas de Petri. Úselo a más tardar 2 años después de la fabricación.

Agar yema. Se añade una suspensión de yema de pollo (20%), glucosa (0,2%), hemina (10 µg/ml) a un medio a base de agar eritritol derretido y enfriado a 56-60 °C y se vierte en placas de Petri. El medio se utiliza para determinar la actividad lecitinasa de patógenos, en particular C. perfringens. En presencia de lecitinasa, se forman zonas de turbidez alrededor de las colonias.

Entorno comercial para el control de esterilidad. Se puede utilizar como transporte. Para mejorar el crecimiento de bacterias anaeróbicas, se pueden agregar a su composición aditivos especiales, como medio 199, hemina, Tween-80, metadiona, citrato de sangre y similares.

Entorno Wilson-Blair. Se prepara a base de MPA de azúcar (glucosa) al 1%, pH 7,4, se funde y se enfría a 60 °C con la adición de 10 ml de solución estéril de sulfito de sodio al 20% y 1 ml de solución de cloruro férrico al 8% por 100 ml. . El medio preparado no está esterilizado.

Se utiliza para el diagnóstico rápido de la infección por anaerobios gaseosos causada por Clostridium perfringens. Después de solo 1-2 años, se observa un cambio en el medio ambiente: se vuelve negro como resultado de la renovación del sulfito de sodio en sulfato, que reacciona con el cloruro férrico formando sulfuro de hierro. Las roturas del agar también aparecen como resultado de una intensa formación de gas.

Leche de tornasol. Prepare el medio con leche fresca. Primero se hierve y se deja en un lugar fresco durante un día. Se retira la capa superior de grasa y se repite el procedimiento. Se filtra la leche y se ajusta el pH a 7,2 con una solución de bicarbonato de sodio al 10%. Antes de la esterilización, se añaden a la leche un 5-10% de tintura de tornasol y una cantidad idéntica de solución de bicarbonato de sodio al 10% para que la espuma de leche adquiera un tono azul violeta. Cuando se agrega leche, se vuelve azul violeta, cuando se agrega leche, se vuelve de rosa a rojo.

10. Métodos de cultivo industrial de bacterias.

Para realizar cualquier proceso biotecnológico es necesario:

Cultivo de microorganismos;

Medio nutritivo;

Equipos para cultivo y operaciones auxiliares;

Herramientas de control y gestión de procesos.

El cultivo es la etapa principal del proceso tecnológico y determina en gran medida las características cuantitativas y cualitativas de la producción de drogas. En la etapa de cultivo, se produce la acumulación tanto de la propia biomasa como de los productos del metabolismo (actividad vital) de los microorganismos.

ganismos. Así, en la producción de preparados bacterianos, el producto objetivo es la propia biomasa, en otros casos los productos sintetizados por la célula son antibióticos, enzimas, aminoácidos, etc. y ser liberado en la mezcla de cultivo.

En el caso de que un cultivo crezca en la superficie de un medio nutritivo líquido o sólido, consumiendo los sustratos que contiene y liberando productos metabólicos en este medio, el método de cultivo se denomina superficial.

Cuando los microorganismos se distribuyen por todo el volumen del medio nutritivo líquido, el cultivo se denomina profundo (fase líquida). En este caso, el oxígeno se suministra a las células como resultado de una operación de mezcla intensiva.

Este último método es actualmente el más utilizado en la producción de la mayoría de los medicamentos por las siguientes razones:

1. Permite obtener una gran cantidad de masa bacteriana en poco tiempo. Así, cuando se cultivan microorganismos del grupo Escherichia coli en condiciones de latencia, el número de microbios no supera los 1-2 mil millones/cm-3, y cuando se utiliza aireación forzada, el rendimiento alcanza los 50-60 mil millones/cm-3.

2. El proceso es fácil de gestionar. Para mantener el crecimiento y la reproducción a largo plazo de los microorganismos durante su cultivo, se introducen adicionalmente compuestos de carbono y nitrógeno y, si es necesario, otros estimulantes del crecimiento.

Este método también permite ajustar fácilmente el pH del medio durante el proceso de cultivo.

3. El proceso es lo más avanzado tecnológicamente posible.

El proceso tecnológico de cultivo profundo de microorganismos en reactores (fermentadores) consta de las siguientes etapas:

Selección de cepas de microorganismos y trabajo con ellas;

Preparación de cultivo microbiano de semillas;

Preparación y esterilización de medios de cultivo;

Preparar el biorreactor para la siembra;

Cultivo de microorganismos en un reactor y control del proceso de cultivo.

Además, incluye una serie de operaciones auxiliares:

Esterilización de equipos y comunicaciones;

Preparación y esterilización de antiespumantes, soluciones, etc.

Veamos cada etapa del cultivo.

Las cepas de referencia de microorganismos se almacenan y mantienen a un nivel determinado en el VGNIKI (Instituto Estatal de Investigación de Ingeniería Celular de toda la Unión) de medicamentos veterinarios. Estas cepas, a su vez, son cepas de producción, ya que a partir de ellas se preparan vacunas.

Además de las cepas de producción y de referencia, en VGNIKI se almacenan cepas de control que se utilizan para evaluar la calidad de los preparados de vacunas. Estas cepas deben ser poblaciones genéticamente homogéneas de microorganismos con propiedades morfológicas, específicas y biológicas estables. Los principales requisitos de estas cepas son sus elevadas propiedades antigénicas e inmunogénicas.

Producción, las cepas de referencia deben conservarse.

estabilidad genética de antígenos, inmunogénicos y otros.

sus propiedades biológicas inherentes durante 10-20

subcultivos sucesivos tanto in vivo como in vitro.

Normalmente, el cultivo industrial de microorganismos se realiza en grandes volúmenes. Por lo tanto, en primer lugar, a partir de la cepa de referencia existente del microorganismo, que suele estar liofilizada en una ampolla, se inoculan en pequeños recipientes, por ejemplo, en una botella con una capacidad de 100-200 cm3, llena de 50-150 ml de medio de producción. Luego, las botellas se siembran en recipientes grandes (botellas con un volumen de 18 a 20 litros). Si hay una buena acumulación de microorganismos, dicho cultivo se introduce en el reactor y se denomina cultivo semilla (maestro). En este caso, primero es necesario calcular la cantidad necesaria de cultivo de semillas para el cultivo industrial de microorganismos en función de la dosis de semillas, que normalmente oscila entre el 1 y el 10% en volumen. Los cultivos microbianos inoculados también se controlan por la preservación de las propiedades morfológicas, bioquímicas, antigénicas e inmunogénicas típicas, así como por la ausencia de microflora extraña (PMF) en ellos.

11. Clasificación internacional y características de las enzimas de microorganismos.

Las enzimas producidas por una célula bacteriana pueden localizarse tanto dentro de la célula como endoenzimas, y ser liberado al medio ambiente - exoenzimas. Las exoenzimas desempeñan un papel importante al proporcionar a la célula bacteriana fuentes de carbono y energía disponibles para la penetración. La mayoría de las hidrolasas son exoenzimas que, liberadas al medio ambiente, descomponen grandes moléculas de péptidos, polisacáridos y lípidos en monómeros y dímeros que pueden penetrar en el interior de la célula. Varias exoenzimas, por ejemplo la hialuronidasa, la colagenasa y otras, son enzimas de agresión. Algunas enzimas se localizan en el espacio periplásmico de la célula bacteriana. Participan en los procesos de transferencia de sustancias a la célula bacteriana. El espectro enzimático es un carácter taxonómico característico de una familia, género y, en algunos casos, especie. Por tanto, la determinación del espectro de actividad enzimática se utiliza para establecer la posición taxonómica de las bacterias. La presencia de exoenzimas se puede determinar utilizando medios de diagnóstico diferencial; por lo tanto, se han desarrollado sistemas de prueba especiales que consisten en un conjunto de medios de diagnóstico diferencial para identificar bacterias.

Según el tipo de reacciones que catalizan, las enzimas se dividen en 6 clases según la clasificación jerárquica de las enzimas (CE, código de la Comisión de Enzimas). La clasificación fue propuesta por la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular. Cada clase contiene subclases, de modo que la enzima se describe mediante un conjunto de cuatro números separados por puntos. Por ejemplo, la pepsina tiene el nombre UE 3.4.23.1. El primer número describe aproximadamente el mecanismo de la reacción catalizada por la enzima:

§ CF 1: Oxidorreductasas, catalizando la oxidación o la reducción. Ejemplo: catalasa, alcohol deshidrogenasa.

§ CF 2: transferasas, catalizando la transferencia de grupos químicos de una molécula de sustrato a otra. Entre las transferasas, se distinguen especialmente las quinasas que transfieren un grupo fosfato, generalmente de una molécula de ATP.

§ CF 3: hidrolasas, catalizando la hidrólisis de enlaces químicos. Ejemplo: esterasas, pepsina, tripsina, amilasa, lipoproteína lipasa.

§ CF 4: Liasas, catalizando la ruptura de enlaces químicos sin hidrólisis con la formación de un doble enlace en uno de los productos.

§ CF 5: isomerasas, catalizando cambios estructurales o geométricos en la molécula del sustrato.

§ CF 6: Ligasas, catalizando la formación de enlaces químicos entre sustratos debido a la hidrólisis del ATP. Ejemplo: ADN polimerasa.

Al ser catalizadores, las enzimas aceleran reacciones tanto directas como inversas, por lo que, por ejemplo, las liasas pueden catalizar la reacción inversa: la adición en dobles enlaces.

12. El papel de las enzimas en la identificación de bacterias. Métodos para determinar enzimas glicolíticas y proteolíticas de bacterias. Medios de diagnóstico diferencial (monosustrato y polisustrato).

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Propiedades culturales de las bacterias.

Una colonia es una colección aislada de células del mismo tipo que crecieron a partir de una célula (clon de células). Dependiendo de dónde crece el microorganismo (en la superficie de un medio nutritivo denso o en su espesor), se distinguen colonias superficiales, profundas y del fondo.

Las colonias cultivadas en la superficie del medio son diversas: son específicas de cada especie y su estudio sirve para determinar la especie del cultivo en estudio.

Al describir las colonias se tienen en cuenta las siguientes características:
1) la forma de la colonia: redonda, ameboide, rizoide, irregular, etc.;

2) tamaño (diámetro) de la colonia: muy pequeña (puntiaguda) (0,1-0,5 mm), pequeña (0,5-3 mm), mediana (3-5 mm) y grande (más de 5 mm de diámetro);

3) la superficie de la colonia es lisa, rugosa, plegada, arrugada, con círculos concéntricos o radialmente estriada;

4) perfil de la colonia: plano, convexo, cónico, cráter, etc.;

5) transparencia: opaca, mate, brillante, transparente, polvorienta;

6) color de la colonia (pigmento): incoloro o pigmentado (blanco, amarillo, dorado, rojo, negro), nótese especialmente la liberación del pigmento al medio con su coloración;

7) borde de la colonia: liso, ondulado, irregular, con flecos, etc.;

8) estructura de la colonia: homogénea, de grano fino o grueso, veteada; el borde y la estructura de la colonia se determinan con una lupa o con un aumento bajo de un microscopio colocando una placa de Petri con la inoculación sobre la mesa del microscopio con la tapa hacia abajo;

9) consistencia de la colonia; se determina tocando la superficie con un asa: la colonia puede ser densa, suave, creciendo en agar, mucosa (se estira detrás del asa), frágil (se rompe fácilmente cuando entra en contacto con el asa).

Las colonias profundas suelen parecerse a lentejas más o menos aplanadas (forma ovalada con extremos puntiagudos), a veces trozos de algodón con excrecencias filiformes en el medio nutritivo. La formación de colonias profundas suele ir acompañada de la ruptura del medio denso si los microorganismos liberan gas.

Las colonias del fondo suelen parecer películas finas y transparentes que se extienden por el fondo.

Las características de la colonia pueden cambiar con la edad, dependen de la composición del medio y de la temperatura de cultivo.

El crecimiento de microorganismos en medios nutritivos líquidos se tiene en cuenta utilizando cultivos de cuatro a siete días cultivados en condiciones estacionarias.

En medios nutritivos líquidos, con el crecimiento de microorganismos, se observa turbidez del medio y la formación de una película o sedimento.

Cuando se cultivan en medios nutritivos semilíquidos (0,5-0,7% de agar), los microbios móviles provocan una turbidez pronunciada, las formas inmóviles crecen solo durante la siembra mediante inyección en el medio.

A menudo, el crecimiento de microbios va acompañado de la aparición de olores, pigmentación del medio ambiente y liberación de gases. El olor característico de los cultivos de algunos tipos de bacterias está asociado con la formación de varios ésteres (acetato de etilo, acetato de amilo, etc.), indol, mercaptano, sulfuro de hidrógeno, escatol, amoníaco, ácido butírico.

La capacidad de formar pigmentos es inherente a muchos tipos de microorganismos. La naturaleza química de los pigmentos es diversa: carotenoides, antocianinas, melaninas. Si el pigmento es insoluble en agua, sólo se tiñe la placa cultural; si es soluble, el medio nutritivo también se colorea. Se cree que los pigmentos protegen a las bacterias de los efectos nocivos de la luz solar, razón por la cual hay tantas bacterias pigmentadas en el aire, además, los pigmentos participan en el metabolismo de estos microorganismos.

En la naturaleza existen las llamadas bacterias fosforescentes, cuyos cultivos brillan en la oscuridad con una luz verdosa azulada o amarillenta. Estas bacterias se encuentran principalmente en el agua de río o de mar. Las bacterias luminosas (fotobacterias) incluyen bacterias aeróbicas (vibrios, cocos, bastones).

Aislamiento de cultivos puros de microorganismos.

El material en estudio (agua, suelo, aire, alimentos u otros objetos) suele contener asociaciones de microbios.

El aislamiento de un cultivo puro permite estudiar las características morfológicas, culturales, bioquímicas, antigénicas y otras, cuyo conjunto determina la especie y el tipo del patógeno, es decir, se realiza su identificación.

Para aislar cultivos puros de microorganismos se utilizan métodos que se pueden dividir en varios grupos:
1. Método de Pasteur: dilución secuencial del material de prueba en un medio nutritivo líquido hasta la concentración de una célula en el volumen (tiene importancia histórica).

2. Método de Koch ("cableado de placas"): dilución secuencial del material de prueba en agar fundido (temperatura 48-50 C), seguido de vertido en placas de Petri, donde el agar solidifica. Las inoculaciones se hacen, por regla general, a partir de las últimas tres o cuatro diluciones, donde las bacterias se vuelven escasas y luego, a medida que crecen en placas de Petri, aparecen colonias aisladas, formadas a partir de una célula madre inicial. A partir de colonias aisladas en lo profundo del agar, se obtiene un cultivo puro de bacterias mediante subcultivo en medios frescos.

3. Método Shukevich: se utiliza para obtener un cultivo puro de Proteus y otros microorganismos con crecimiento "rastrero". El material de prueba se inocula en agua de condensación en la base del agar inclinado. Los microbios móviles (Proteus) pueden ascender por el agar inclinado, mientras que las formas inmóviles permanecen para crecer debajo, en el lugar de siembra. Al resembrar los bordes superiores del cultivo, se puede obtener un cultivo puro.

4. Método Drigalsky: ampliamente utilizado en la práctica bacteriológica, en el que el material en estudio se diluye en un tubo de ensayo con solución salina o caldo estéril. Se añade una gota del material a la primera copa y se extiende sobre la superficie del medio con una espátula de vidrio esterilizada. Luego, con la misma espátula (sin quemarla en la llama del quemador), se hace la misma siembra en la segunda y tercera copa.

Con cada inoculación de bacterias, cada vez queda menos en la espátula y, al sembrar en la tercera taza, las bacterias se distribuirán sobre la superficie del medio nutritivo por separado. Después de 1 a 7 días de mantener las placas en un termostato (dependiendo de la tasa de crecimiento de los microorganismos), en la tercera placa, cada bacteria produce un clon de células, formando una colonia aislada, que se subcultiva en agar inclinado para acumularla. una cultura pura.

5. Método Weinberg. Surgen dificultades especiales al aislar cultivos puros de anaerobios obligados. Si el contacto con el oxígeno molecular no provoca inmediatamente la muerte celular, la siembra se realiza según el método Drigalsky, pero después las placas se colocan inmediatamente en un anaerostato. Sin embargo, el método de reproducción se utiliza con mayor frecuencia. Su esencia radica en que la dilución del material en estudio se realiza en un medio nutritivo agar fundido y enfriado a 45-50 oC.

Se hacen de 6 a 10 diluciones sucesivas, luego se enfría rápidamente el medio en los tubos de ensayo y se cubre la superficie con una capa de una mezcla de parafina y vaselina para evitar que el aire penetre en la densidad del medio nutritivo. A veces, el medio nutritivo, después de sembrar y mezclar, se transfiere a tubos Burri estériles o pipetas Pasteur capilares, cuyos extremos están sellados. Con una dilución exitosa, crecen colonias aisladas de anaerobios en tubos de ensayo, tubos Burri y pipetas Pasteur. Para garantizar que las colonias aisladas sean claramente visibles, se utilizan medios nutritivos clarificados.

Para extraer colonias aisladas de anaerobios, el tubo se calienta ligeramente girándolo sobre una llama, mientras el agar adyacente a las paredes se derrite y el contenido del tubo en forma de columna de agar se desliza hacia una placa de Petri estéril. Se corta la columna de agar con unas pinzas esterilizadas y se retiran las colonias con un asa. Las colonias extraídas se colocan en un medio líquido favorable para el desarrollo de microorganismos aislados. El medio agar se extrae del tubo Burri haciendo pasar el gas a través de un tapón de algodón.

6. Método Hungate. Cuando se quieren obtener colonias aisladas de bacterias con una sensibilidad especialmente alta al oxígeno (aerobios estrictos), se utiliza el método del tubo giratorio de Hungate. Para ello, se inoculan bacterias en el medio de agar fundido a corriente constante a través de un tubo de ensayo de gas inerte libre de impurezas de oxígeno. Luego se sella el tubo con un tapón de goma y se coloca horizontalmente en una abrazadera que hace girar el tubo; el medio se distribuye uniformemente sobre las paredes del tubo de ensayo y se solidifica formando una capa fina. El uso de una fina capa en un tubo de ensayo lleno de una mezcla de gases permite obtener colonias aisladas que son claramente visibles a simple vista.

7. Aislamiento de células individuales mediante un micromanipulador. Un micromanipulador es un dispositivo que le permite eliminar una célula de una suspensión utilizando una micropipeta o un microbucle especial. Esta operación se controla bajo un microscopio. En la platina del microscopio se instala una cámara húmeda, en la que se coloca la preparación de la gota colgante. Las micropipetas (micropipetas) se fijan en soportes de soportes operativos, cuyo movimiento en el campo de visión del microscopio se realiza con precisión micrométrica gracias a un sistema de tornillos y palancas. El investigador, mirando a través de un microscopio, extrae células individuales con micropipetas y las transfiere a tubos que contienen un medio líquido estéril para obtener un clon celular.

L.V. Timoschenko, M.V. Chubik

Técnica de siembra de microorganismos El método bacteriológico (aislamiento de cultivos puros de microbios y su posterior identificación) es de gran importancia en el diagnóstico de enfermedades infecciosas, en el estudio del estado sanitario e higiénico de los objetos ambientales (agua, aire, suelo, alimentos) y su estudio según indicadores epizoóticos y epidemiológicos de contaminación por especies microbianas patógenas. Sin embargo, la primera etapa de esta técnica consiste en sembrar o resembrar el cultivo bacteriano en varios tipos de medios nutritivos.

El material de siembra puede ser subcultivo de cultivos bacterianos, diversas secreciones animales y humanas, tejido de cadáveres, agua, tierra y alimentos.

El material líquido para inoculación se toma con un asa o una pipeta. Cuando se toma con un asa, el líquido debe formar una fina película transparente en el anillo del asa: un "espejo". Las pipetas se utilizan cuando el material se inocula en un volumen grande o medido con precisión.

Arroz. 4. Esquema de resiembra de cultivos microbianos de un tubo de ensayo a otro.

El método para tomar material denso está determinado por su consistencia. Al sembrar, se utiliza con mayor frecuencia un asa bacteriana. Todas las manipulaciones asociadas con la siembra y el aislamiento de cultivos microbianos se realizan sobre la llama de un quemador. El bucle bacteriano se calienta sobre una llama inmediatamente antes de tomar el material y luego se enfría el bucle. Para hacer esto, cuando se vuelve a sembrar un cultivo microbiano de un tubo de ensayo, el circuito caliente se sumerge en un líquido de condensación, y cuando se vuelve a sembrar desde placas de Petri, se toca la superficie del medio nutritivo, libre de crecimiento microbiano. Un circuito suficientemente enfriado no provoca que el líquido de condensación silbe y no derrite el agar al entrar en contacto con el medio. Una vez completada la siembra, el asa se quema nuevamente para destruir el cultivo microbiano que se encuentra en él o el material infectado con microorganismos.

Las pipetas y espátulas utilizadas para la inoculación, así como los bucles bacterianos, se queman antes de la inoculación y, después de la inoculación, se sumergen en una solución desinfectante.

Antes de sembrar, se verifica la integridad de todas las placas, luego, en las placas de Petri desde abajo, en los tubos de ensayo en el tercio superior, se escribe el nombre del material inoculado o se indica el número de análisis y la fecha de siembra.

Técnica de siembra en medios nutritivos sólidos y líquidos.

2. Al inocular en agar inclinado de peptona de carne, se toma el tubo de ensayo con la mano izquierda entre los dedos I y II de modo que la base del tubo quede sobre la superficie de la mano y la inoculación se realiza bajo control ocular. Retire el tapón del tubo de ensayo con la mano derecha utilizando los dedos V y IV, sin tocar la parte del tapón que va dentro del tubo de ensayo. Los 3 dedos restantes de la mano derecha quedan libres para tomar el asa bacteriana, a través del cual se realiza la inoculación. El lazo se sujeta como un bolígrafo. Después de quitar el tapón, el tubo de ensayo con el medio nutritivo se mantiene en posición inclinada para evitar que entren microorganismos extraños desde el aire.

Se inserta un bucle con el material subcultivo en el tubo de ensayo hasta el fondo, se baja plano sobre la superficie del medio nutritivo y se aplica un trazo con movimientos deslizantes de abajo hacia arriba, de una pared del tubo de ensayo a la otra. (Figura 4).

3. Al sembrar en la superficie de un medio nutritivo denso en placas de Petri, la placa se sostiene con la mano izquierda. La parte inferior se sujeta por un lado con los dedos I y II y por el otro con los dedos IV y V. La tapa, ligeramente abierta para que un bucle o espátula pueda pasar libremente por el hueco resultante, se fija con los dedos I y III o I y II. Se frota una pequeña cantidad del material de prueba con un asa bacteriana en la superficie del medio nutritivo en el borde del plato (Fig. 5). Luego se quema el bucle para destruir el exceso de material que tenga. La línea de siembra parte del lugar donde se encuentra el material. El asa bacteriana se coloca plano sobre el medio nutritivo para no rayar su superficie y se realizan trazos por todo el medio o por sectores, habiendo previamente dibujado el fondo del vaso (siempre que el medio sea transparente) en varias partes iguales. . Se debe intentar que los trazos aplicados por el bucle estén lo más cerca posible entre sí, ya que esto alarga la línea de siembra general y permite obtener colonias aisladas de microorganismos.

Arroz. 5. Siembra en un medio nutritivo denso en placas de Petri.

Para distribuir uniformemente el material inoculado sobre la superficie del medio nutritivo denso, puede utilizar un tampón o una espátula en lugar de un asa.

Cuando hay abundancia de microbios en el material inoculado, estos crecen en forma de una película que cubre toda la superficie del medio nutritivo. Este tipo de crecimiento microbiano se llama crecimiento continuo o de césped. La siembra de césped se realiza cuando es necesario obtener grandes cantidades de un cultivo microbiano de un tipo.

4. A partir del material a inocular, en una capa de medio nutritivo denso, se prepara una suspensión en agua del grifo esterilizada o en una solución isotónica. Tome 0,1-1 ml de la suspensión con una pipeta (según el grado de sospecha de contaminación microbiana) y viértala en una placa de Petri vacía y estéril. Después de eso, la taza se llena con 15-20 ml de agar peptona de carne, se derrite y se enfría a una temperatura de 40-45 ° C (a esta temperatura, un tubo de ensayo con el medio aplicado en la mejilla no debe causar ardor). sensación). Para garantizar una distribución uniforme del material de prueba en el medio nutritivo, el vaso cerrado con el contenido se gira ligeramente sobre la superficie de la mesa.

5. La siembra por inyección en columna de medio nutritivo se realiza en un tubo de ensayo con el medio congelado en forma de columna. Se toma el tubo de ensayo con la mano izquierda, como de costumbre, y se pega un lazo con el material en el centro de la columna hasta el fondo del tubo de ensayo.

Obtención de cultivos puros

El aislamiento de un cultivo puro de microbios es una etapa obligatoria de cualquier estudio bacteriológico. El cultivo puro es necesario para el estudio de las propiedades morfológicas, culturales, bioquímicas y antigénicas, cuyo conjunto determina la especie del microorganismo en estudio.

Se han propuesto muchos métodos diferentes para aislar cultivos puros de microbios a partir de materiales que contienen abundante microflora mixta. El método más utilizado es la separación mecánica de los microorganismos ubicados en el material en estudio con el fin de obtener colonias aisladas en la superficie o en las profundidades del medio nutritivo.

Los medios nutritivos electivos se utilizan ampliamente para estimular el desarrollo de aquellos microorganismos cuyo cultivo puro se supone aislado.

Algunos tipos de microbios son muy sensibles a ciertos factores ambientales. La resistencia individual de los microbios a uno u otro factor se utilizó para desarrollar métodos para aislar cultivos puros matando la microflora que los acompaña. Este método permite aislar formas de esporas de microbios resistentes a las altas temperaturas, las micobacterias tuberculosis, que son indiferentes a la acción de soluciones concentradas de ácidos minerales, a diferencia de otros microbios contenidos en el esputo.

Al aislar un cultivo puro de microbios patógenos a partir de material patológico contaminado con microflora extraña, a veces se recurre a infectar animales de laboratorio que son susceptibles al tipo de microbio que se supone que se debe aislar del material en estudio. El método biológico de aislar un cultivo puro se utiliza para examinar el esputo en busca de neumococos y Mycobacterium tuberculosis.

Se conocen relativamente pocos métodos para aislar bacterias como cultivos puros. Esto se hace con mayor frecuencia aislando células individuales en un medio de cultivo sólido, utilizando el método de siembra en placas o vertiendo una pequeña cantidad de cultivo líquido en placas. Sin embargo, obtener una colonia separada no siempre garantiza la pureza del cultivo, ya que las colonias pueden crecer no solo a partir de células individuales, sino también de sus grupos. Si los microorganismos forman moco, a menudo se le adhieren formas extrañas. En caso de aislamiento de cepas. Bacilo o actinomicetos, los microorganismos contaminantes pueden enredarse en cadenas de células o, en consecuencia, en hifas de estos microbios. Para la purificación es preferible utilizar un medio no selectivo, ya que en él los microorganismos contaminantes crecen mejor y son más fáciles de detectar. Pero incluso en un medio no selectivo, las colonias no deben seleccionarse muy rápidamente, ya que las bacterias contaminantes de crecimiento lento pueden no crecer en un período de tiempo determinado.

Generalmente crecen colonias idénticas a partir de un cultivo puro y la microscopía revela células similares, en particular en tamaño y tinción de Gram. Sin embargo, son posibles excepciones, por ejemplo, las colonias que crecen a partir de un cultivo puro pueden ser lisas (S) o rugosas (R). Además, en cultivos puros de diversos microorganismos pueden aparecer células cocoides, quistes y esporas. Finalmente, algunos microorganismos exhiben variabilidad de gramos. Sin embargo, estos criterios se utilizan ampliamente para determinar la pureza de los cultivos.

Sembrando con un toque

EN GRAMOD

Arroz. 6. Un método conveniente de siembra en placas para obtener colonias individuales. A. Para marcar la parte posterior de la placa de Petri, aplica la letra T con un lápiz, dividiendo el fondo en 3 sectores. B. Utilizando un bucle de cultivo en zigzag, raye la superficie del agar en el sector 1, como se muestra en la figura. Para ello, primero se levanta la tapa de la taza y, después de aplicar el trazo, se cierra inmediatamente. El asa se esteriliza al fuego y se deja enfriar (15 s). B. Dibuje un bucle a lo largo de la superficie del medio en el sector 1, como se muestra en la figura, y luego aplique inmediatamente trazos en zigzag en la superficie del medio en el sector 2. Caliente el bucle en la llama y déjelo enfriar. D. Pase un bucle a lo largo de la superficie del medio en el sector 2, como se muestra, y luego aplique trazos en zigzag con él sobre la superficie del medio en el sector 3. E. Incubar las copas al revés, como se muestra en la figura. para que el agua condensada de la tapa no entre en la superficie del agar. En el sector 1 crece un gran número de colonias, mientras que en los sectores 2 y 3 aparecen colonias individuales bien aisladas.

Obtención de un cultivo puro mediante tamizado en las profundidades del medio (según Koch)

Después de que el medio con el material de prueba se haya gelificado, las copas se colocan en un termostato. El número de colonias en las placas de medio de cultivo disminuye a medida que se diluye el material.

Aislamiento de cultivo puro mediante el método Drigalsky.

El método de tamizado superficial propuesto por Drigalsky es el método más utilizado para obtener un cultivo puro de microbios. En lugar de una espátula, puedes usar un lazo. El material sobre el medio nutritivo se distribuye en trazos paralelos por toda la copa en una dirección. Luego, girando la copa 180°, se realizan trazos en dirección perpendicular a los primeros trazos. Con este método de siembra, el material del bucle se consume gradualmente y colonias aisladas de microbios crecen a lo largo de las líneas de la cuadrícula dibujadas al final de la siembra.

Anaerostato para el cultivo de anaerobios.

Aislamiento de cultivos puros de aerobios. Suele tardar tres días y se realiza según el siguiente esquema:

Día 1: microscopía de un frotis del material de prueba, teñido (generalmente con Gram), para una familiarización preliminar con la microflora, que puede ser útil para elegir un medio nutritivo para la inoculación. Luego, el material se inocula sobre la superficie de agar nutritivo solidificado para obtener colonias aisladas. El tamizado se puede realizar mediante el método Drigalski en tres placas de Petri con un medio nutritivo. Se aplica una gota de material a la primera copa y se extiende con una espátula por toda la copa. Luego, con la misma espátula, distribuye el resto de la cosecha en la segunda taza y de la misma forma en la tercera. La mayor cantidad de colonias crecerá en la primera placa, la más pequeña, en la tercera. Dependiendo de cuántas células microbianas había en el material en estudio, crecerán colonias aisladas en una de las placas.

Se puede lograr el mismo resultado tamizando una taza. Para ello, divida la copa en cuatro sectores. El material en estudio se inocula con un asa bacteriológica en rayas en el primer sector, luego, luego de calcinar y enfriar el asa, se distribuye la inoculación del primer sector al segundo y de la misma manera secuencialmente al tercer y cuarto sector. Las colonias aisladas se forman a partir de células microbianas individuales después de una incubación diaria en un termostato.

Día 2: estudio de colonias cultivadas en platos, describiéndolas. Las colonias pueden ser transparentes, translúcidas u opacas, tienen diferentes tamaños, contornos redondos regulares o irregulares, forma convexa o plana, superficie lisa o rugosa, lisa u ondulada, bordes dentados. Pueden ser incoloros o blancos, dorados, rojos, amarillos. A partir del estudio de estas características, las colonias cultivadas se dividen en grupos. Luego se selecciona una colonia aislada del grupo de estudio y se prepara un frotis para examen microscópico para verificar la homogeneidad de los microbios en la colonia. La misma colonia se inocula en un tubo de ensayo con agar nutritivo inclinado.

Día 3: comprobar la pureza del cultivo cultivado en agar inclinado mediante microscopía de frotis. Si las bacterias en estudio son homogéneas, el aislamiento de un cultivo puro puede considerarse completo.

Para identificar bacterias aisladas se estudian las características culturales, es decir, el patrón de crecimiento en medios nutritivos líquidos y sólidos. Por ejemplo, los estreptococos forman sedimentos en el fondo y las paredes del caldo de azúcar y colonias pequeñas y puntiformes en el agar sangre; Vibrio cholerae forma una película en la superficie del agua de peptona alcalina y colonias transparentes en agar alcalino; El bacilo de la peste forma colonias en agar nutritivo en forma de "pañuelos de encaje" con un centro denso y bordes delgados y ondulados, y en un medio nutritivo líquido, una película en la superficie y luego hilos que salen de ella en forma de "estalactitas". ”.

Aislamiento de cultivos puros de bacterias anaeróbicas:

Los métodos químicos implican colocar platos con anaerobios inoculados en un desecador herméticamente cerrado, donde se colocan productos químicos, por ejemplo, pirogalol y álcali, cuya reacción se produce con la absorción de oxígeno.

El método biológico se basa en el cultivo simultáneo de anaerobios y aerobios en medios nutritivos sólidos en placas de Petri, cerradas herméticamente después de la siembra. Primero, los aerobios en crecimiento absorben oxígeno y luego comienza el crecimiento de los anaerobios.

El aislamiento de un cultivo puro de anaerobios comienza con la acumulación de bacterias anaerobias mediante siembra en medio de Kitta-Tarozzi. Posteriormente, las colonias aisladas se obtienen de dos maneras.

El objetivo de la segunda etapa del método bacteriológico: obtener un cultivo puro de microorganismos y su acumulación. Para hacer esto:

· Estudio macroscópico de colonias en luz transmitida y reflejada (características de tamaño, forma, color, transparencia, consistencia, estructura, contorno, superficie de las colonias).

· Examen microscópico de colonias aisladas y luego preparación y examen de frotis de estas colonias.

· Siembra de colonias características de una determinada especie en medios de acumulación de cultivo puro o medios selectivos e incubación en condiciones óptimas.

Las características culturales de los microbios están determinadas por la naturaleza de su crecimiento en medios nutritivos. Al ser constantes para cada tipo de microbio, son un signo diagnóstico importante.

Al aislar un cultivo puro de un microorganismo, se debe prestar atención al patrón de crecimiento del microbio, es decir. sobre las características culturales como una de las características que permite identificar el género o tipo de microorganismo. Cuando se cultiva un microbio en medio líquido, el crecimiento bacteriano se puede observar en forma de:

a) turbidez difusa;

b) crecimiento del fondo y de la pared en un medio transparente;

c) película superficial;

d) “un trozo de algodón”.

En medios semilíquidos se puede observar:

a) crecimiento difuso alrededor de la inoculación (bacterias móviles);

b) crecimiento a lo largo del curso de la inyección (bacterias inmóviles);

c) ruptura del medio o formación de burbujas de gas.

En medios densos se observa lo siguiente:

a) crecimiento en colonias separadas;

b) crecimiento en floración continua.

Crecimiento de microbios en un medio nutritivo sólido. Para estudiar las propiedades de las colonias, se cultivan microbios en medios nutritivos sólidos en placas de Petri. Al sembrar material, intentan obtener un crecimiento aislado de colonias.

Según la naturaleza de las colonias, se distinguen los siguientes tipos:

· Tipo S (del inglés smooth - smooth): las colonias se caracterizan por una forma redonda y convexa, una superficie lisa y una consistencia húmeda;

· Las colonias tipo R (del inglés rugoso – rugoso) se caracterizan por una superficie rugosa, bordes irregulares y consistencia seca. Se forman a partir de formas S suaves como resultado de mutaciones. La transición de las formas S a las formas R se observa durante la disociación. El fenómeno de disociación en microbios patógenos se observa bajo la influencia de antibióticos y quimioterapia, factores de inmunidad específicos que se forman durante el proceso infeccioso, así como factores ambientales.

· Además de estos dos tipos principales de colonias, existe una mucosa de tipo M (del latín mucus - mucous), caracterizada por una consistencia mucosa viscosa. Formado durante la disociación de cultivos bacterianos.

Cada tipo de bacteria forma colonias con características diferentes. Su carácter se estudia a simple vista en luz transmitida y reflejada, así como utilizando una lupa o un microscopio de bajo aumento. Al comienzo del estudio, gire el fondo de la copa hacia usted y examínelas con luz transmitida. Si hay diferentes colonias, cada una de ellas se numera y se describe por separado. El protocolo señala las siguientes características.

1. Tamaño de las colonias determinado por su diámetro (grande - con un diámetro de 4-6 mm o más, mediano - 2-4 mm, pequeño - 1-2 mm y puntiagudo - menos de 1 mm).

2. Forma de las colonias(redondo regular, irregular en forma de ameba, en forma de roseta, rizoide en forma de raíz, que recuerda a raíces de árboles entrelazadas, etc.).

3. Grado de transparencia(opaco, translúcido, transparente).

4. Estructura de la colonia. Según la naturaleza de la estructura, se distinguen los siguientes tipos de colonias:

· hialino - incoloro, transparente, sin una estructura visible específica;

· granular, que, según el tamaño de los granos, se divide en fino y grueso;

· filamentosa o fibrosa, caracterizada por la presencia de hilos largos y densamente entrelazados en el espesor de la colonia. Las colonias pueden ser homogéneas o heterogéneas. La estructura de la primera es la misma en todas sus partes, mientras que en la segunda la parte central difiere de la periférica, o los sectores individuales tienen una estructura diferente al resto de la masa.

5. Color de la colonia determinado por el pigmento producido por el cultivo microbiano. La inmensa mayoría de las bacterias patógenas no producen pigmento, por lo que sus colonias son incoloras o de color lechoso-turbio, similar al ópalo. A la luz transmitida, estas colonias son más o menos transparentes. Las especies de microbios formadores de pigmentos producen colonias de varios colores: crema, amarillo, naranja dorado, azul, rojo, lila, negro, etc.

6. Carácter superficial(rugoso, brillante, mate, seco, húmedo, liso, estriado radial o concéntricamente).

7. La naturaleza del contorno del borde. Hay bordes lisos en forma de línea claramente definida y bordes irregulares. Estos últimos se dividen en:

· borde festoneado, formado por dientes grandes, ligeramente redondeados o aplanados, de forma regular;

· un borde ondulado, que se diferencia algo del festoneado en que sus grandes dientes no están claramente definidos;

· borde erosionado o dentado, formado por dientes afilados de diversos tamaños y formas;

· borde con flecos con delicadas fibras. En algunos casos, no existe una línea claramente definida que delimite la colonia de la superficie del medio. Este borde de la colonia se llama difuso.

8. Alivio caracterizado por su elevación sobre la superficie del medio nutritivo y el contorno de la forma en una sección vertical. Hay relieves convexos, deprimidos, planos, cónicos, abovedados, planos con el centro cónico, con bordes engrosados ​​​​en forma de rodillos, etc.

9. Consistencia de la colonia, que determina su estado físico, se examina tocándolo o quitándole parte del material con un asa bacteriológica con un asa bacteriana. Dependiendo de la consistencia de la colonia, existen:

· pastosa, fácil de quitar y lavar sobre la superficie del medio nutritivo como si fuera mantequilla;

viscoso o viscoso, pegado y arrastrado detrás de un bucle

· fibroso o coriáceo, denso, eliminado de la superficie del medio nutritivo en forma de película elástica correspondiente al tamaño y forma de la colonia;

· bucles frágiles, secos y que se desmoronan al tocarlos.

Las colonias de algunos tipos de bacterias crecen en la densidad del medio nutritivo, lo que también está determinado por un circuito bacteriológico.

10. Olor- un signo menos importante de colonias, ya que las asociaciones que evoca son subjetivas. Muchos tipos de bacterias, cuando crecen en medios nutritivos, liberan sustancias aromáticas específicas. En particular, los cultivos de Pseudomonas aeruginosa huelen a caramelo, los cultivos de Listeria - suero, Nocardia - tierra recién excavada, Proteus - un olor pútrido.

III. plan de trabajo practico

1. Estudiar las propiedades culturales de las colonias cultivadas en AMP (repaso de cultivos realizado en la lección anterior)

2. Tamizar la colonia aislada (cultivo puro) (en rayas) en el medio de acumulación (MPA en pendiente)

3. Estudiar y dibujar los patrones de crecimiento de diversas bacterias en medios nutritivos simples y complejos.

4. Complete la tabla “Clasificación de microorganismos por tipo de respiración”

5. Resolver problemas situacionales